鸭疫里默氏菌脂多糖合成关键基因LpsA的功能解析

Riemerella anatipestifer（RA）infection is a major disease confronting the duck industry throughout the world due to high morbidity and mortality. RA is a frequently isolated and very important veterinary bacterial pathogen. Lipopolysaccharide (LPS) is a main component of the Gram-negative bacterial out membrane. LPS is composed of lipid A, core oligosaccharide and O-antigens. LPS is an important virulence factor and contribute to the immune response, pathogenesis and serological classification. First, LPS structure will be determined after isolation and purification. Second, bioinformatics analysis results showed that a 939bp DNA sequence (LpsA) was a LPS biosynthesis key gene and associated with virulence based on the complete genome sequence of RA. Third, RA mutant strain will be constructed by deleting the LpsA gene. Fourth, we will compare the LPS structure of RA mutant strain with the parent strain and investigate whether LpsA is an important virulence factor. Fifth, the characteristics, invasion and pathogenicity of RA mutant strain will be investigated. At last, we will detect the safety, immune efficacy and protection index in ducks against the challenge of the mutation strain.

鸭疫里默氏菌病是目前危害世界各国水禽业最为严重的传染病之一，其病原鸭疫里默氏菌（RA）是重要的兽医病原微生物。脂多糖是革兰氏阴性菌主要的表面成分，包括脂质A，核心多糖和O-抗原，是细菌重要的毒力因子，同时在致病机理、激活机体免疫系统及血清学分类等方面具有重要作用。首先对RA脂多糖进行分离纯化鉴定并解析其化学结构。其次在完成对RA全基因组序列测定并进行生物信息学分析，结果显示一段长度为939bp的编码序列（LpsA）与脂多糖合成关键基因高度同源，提示该基因与毒力密切相关。然后以该基因作为重组靶位点，以RA疫苗株为亲本，通过同源重组整合到RA基因组中，筛选重组阳性菌株。对获得的基因缺失株的脂多糖进行化学结构解析，比较与亲本疫苗株脂多糖结构的差异，确定脂多糖结构变化与其毒力强弱的关系，并研究基因缺失株的生物学特性、黏附、侵袭力以及对鸭的安全性、免疫效力及攻毒保护。

背景：鸭疫里默氏菌主要引起鸭、鹅、火鸡以及其他禽类严重的败血症，是目前危害世界各国水禽业最为严重的传染病之一。脂多糖是革兰氏阴性菌主要的表面成分，包括脂质A，核心多糖和O-抗原，是细菌重要的毒力因子，同时在致病机理、激活机体免疫系统及血清学分类等方面具有重要作用。目前就鸭疫里默氏菌的脂多糖化学结构、合成及遗传调控尚未见相关报道。研究内容：（1）对RA脂多糖进行分离纯化鉴定并解析其化学结构；（2）完成对RA全基因组序列测定并进行生物信息学分析；（3）以脂多糖合成关键基因LpsA作为重组靶位点，以鸭疫里默氏菌疫苗株为亲本，通过同源重组整合到RA基因组中，筛选重组阳性菌株；（4）对获得的基因缺失株的生物学特性、黏附、侵袭力以及对鸭的安全性、免疫效力及攻毒保护进行评价分析。重要结果：获得了RA脂多糖完整的的化学结构，构建了RA脂多糖合成关键基因LpsA缺失菌株，确定了RA脂多糖合成关键基因LpsA与其毒力关系，确定LpsA基因缺失株的生物学特性、黏附和侵袭力，完成了基因缺失株对鸭安全性试验、免疫及攻毒保护试验。关键数据：（1）发表学术论文4篇，其中SCI收录论文3篇，申请专利2项，学术会议论文3篇；（2）培养毕业硕士研究生5名；（3）首次揭示了鸭疫里默氏菌O-抗原的化学结构，解析了与其相应的O-抗原基因簇，这一发现为阐明鸭疫里默氏菌的血清分型及其致病机制提供了新的方向。