PD-1 抗体逆转负载Exosomes 的树突状细胞活化的CD8+T 细胞的失能状态

Advanced primary liver cancer is featured with poor prognosis and shortened survival time. Dendritic cells (DC) loaded with exosomes exhibit certain therapeutic effect in the treatment of hepatocellular carcinoma in mice and tolerance, however, is quickly induced. It was shown in our study that exosome-loaded DC (DC-TEX) activated the tumor-specific CD8+T cells and the activated CD8+T cells expressed programmed cell death-1(PD-1) receptors, which bound to PDL-1 ligand in tumor tissue and induced the anergy status of the cells. And PD-1 antibody applied at different time points after DC-TEX produced different anti-tumor effects. We hypothesized that PD-1 antibody could reverse the anergy status of the CD8+T cells activated by DC-TEX and that the reversion was related to the time when the PD-1 antibody was applied. It was designed in this study to confirm that PD-1 antibody reversed the exhausted status of DC-TEX-activated CD8+T cells in CD8+T gene knockout mice. Changes of CD8+T cells and PD-1+CD8+T cells were observed by flow cytometry at different time points after DC-TEX, and PD-1 antibody was applied at different time points and the effect on hepatocellular carcinoma in mice was observed，providing a scientific basis for solving the tolerance issue of DC-TEX.

晚期原发性肝癌的预后差，生存期短。负载外泌体（Exosomes）的树突状细胞（DC）（DC-TEX）在小鼠原位肝癌中的治疗中虽然取得一定的疗效，但很快产生耐受。我们研究发现，DC-TEX 能够激活肿瘤特异的CD8+T细胞，而活化的CD8+T细胞表达的程序性死亡受体1（PD-1）与肿瘤组织中的PDL-1配体结合，诱导其失能。而在DC-TEX后不同时间点应用PD-1抗体产生不同的抗肿瘤作用。假设PD-1抗体能够逆转DC-TEX活化的CD8+T细胞的失能状态，且与应用PD-1抗体的时间有关。课题组拟通过CD8+T细胞基因敲除鼠证实PD-1抗体逆转DC-TEX活化的CD8+T细胞的失能状态。并应用流式细胞术观察DC-TEX后不同时间点的CD8+T细胞及PD-1+CD8+T细胞的变化，然后在不同时间点应用PD-1抗体，观察对小鼠原位肝癌疗效影响，为解决DC-TEX耐受问题提供科学依据。

目前原发性肝癌是最常见的消化系统肿瘤之一，其恶性程度高，且早期诊断困难，多数患者在诊断时已为晚期。目前一些研究也证实了免疫治疗在原发性肝癌中的疗效和作用。我们将负载Exosomes的树突状细胞与PD-1抗体联合应用，在给予DC-TEX后的不同时间点给予PD-1抗体产生不同的抗肿瘤作用。应用免疫磁珠分离小鼠脾脏来源的T细胞，将分离后获得CD8+T细胞在体外与DC-TEX共培养，在不同的时间点观察CD8+T细胞表面的PD-1表达的情况，从共培养的0小时至72小时PD-1的表达逐渐增加，72小时后PD-1的表达开始下降。应用CFSE标记PD-1+CD8+T细胞，并在不同的时间点加入PD-1抗体，发现72小时的PD-1+CD8+T细胞增殖能力最强。观察PD-1+CD8+T细胞及PD-1抗体在体外对Hepa1-6细胞的杀伤作用，发现72小时组在不同效靶比例中均显示出最强的杀伤作用。随后选择了两个不同的时间点进一步分析发现，GranzymeB+CD8+T细胞、Perforin+CD8+T细胞、IFN-γ+CD8+T及TNF-α+CD8+T均显示显著性的差异。应用Balbc裸鼠构建皮下瘤肝癌模型，然后给予DC-TEX治疗并分析PD-1的表达，结果显示没有没有显著性差异。应用胸腺细胞将裸鼠的免疫功能重建后，再给予DC-TEX治疗，可以观察到PD-1的表达随着时间的推移呈现下降的趋势。进一步应用ELISA分析外周血的IFN-γ、TNF-α及IL-2也呈现显著性的差异。另外我们应用DENA化学诱发的肝癌模型进一步观察了PD-1抗体联合DC-TEX的体内抗肿瘤作用，结果显示不同的时间点应用PD-1抗体对DC-TEX产生不同的抗肿瘤作用。该研究明确了Exosomes 被DC 提呈后能够有效激活CD8+T 细胞，从而发挥特异的抗肿瘤作用。而活化的CD8+T 细胞表达的PD-1 受体与肿瘤组织中PD-L1 配体结合，使CD8+T 处于失能状态，从而减弱了抗肿瘤作用。PD-1 抗体可以有效的阻断PD-1 受体与PD-L1 配体的结合，使失能的CD8+T 细胞恢复功能。将含有肿瘤抗原的Exosomes 被DC 提呈并激活CD8+T 细胞后在不同的时间点给予PD-1 的抗体，对失能的CD8+T 细胞的功能恢复产生影响。该研究为肝癌的免疫治疗提供了一定的理论基础。