Yamanaka因子三维纳米基因传递系统的构建及其诱导多能干细胞研究

本项研究重在构建安全、高效、长效的Yamanaka因子三维纳米基因传递系统，考察其作为新型非病毒载体介导iPS细胞形成的可能性。主要内容包括：细胞外基质（ECM）对原代体细胞的黏附性能；DNA-磷酸钙纳米粒的ECM修饰与二维基因转染；三维纳米支架的制备与性质研究，ELISA法测定三维基因转染效率，以Sox2质粒为模型基因，推测基因转染效率、持续时间与支架黏附性能、降解速率、DNA-纳米粒用量等影响因素之间的定量关系，以期实现因子表达水平和表达时间的定量调控。通过观察iPS细胞的形态特征筛选细胞克隆，探寻克隆形成速度和诱导效率与Yamanaka因子表达水平、持续时间之间的定量关系；通过检测iPS细胞的特异性标志分子、基因表达模式、特定基因启动子区域甲基化程度和畸胎瘤实验，对所诱导的iPS细胞进行鉴定，评价其多能性。本项研究可为iPS细胞外源基因的导入提供新方法、新载体。

本课题重点围绕Yamanaka因子（Y）三维纳米基因传递系统构建及其在诱导多能干（iPS）细胞方面开展研究，主要内容包括：1.成功制备并表征了Y-磷酸钙纳米粒和Y-多糖纳米粒，结果显示：纳米粒呈球形或类球形，粒径小，能有效滞留质粒在凝胶中的迁移；2. 选用FN、RGD多肽、FG以及不同天然多糖对细胞黏附性进行了考察；3. 采用黏附性好的多糖对Y-磷酸钙纳米粒进行修饰，制备Y-多糖-磷酸钙混杂纳米粒，ELISA法评价其基因转染效率，活细胞工作站对其核转运机理进行了初步探索，结果证明：杏鲍菇多糖修饰的Y-多糖-磷酸钙混杂纳米粒转染效率高，在12h内明显观察到纳米粒携带目的基因由胞浆向核仁转运；4. 免疫荧光法检测到Y-磷酸钙纳米粒转染后的细胞成功表达了Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4（OSCK）四个目的蛋白，启动体细胞重编程；5. 制备并评价了胶原、壳聚糖等不同三维纳米支架（3-DNS），研究了质粒在其中的释放动力学，考察了三维基因转染效率、持续时间与影响因素间的定量关系及其调控机制，筛选出胶原支架等适于三维基因传递的载体；6. 筛选、鉴定iPS细胞克隆，检测iPS特异性标志分子和碱性磷酸酶的表达，考察了不同3-DNS中iPS细胞的诱导速度和效率，探讨了诱导速度、效率与基因表达水平、持续时间的相关性，结果表明：磷酸钙3-DNS和多糖修饰的磷酸钙3-DNS均能成功诱导生成iPS克隆，但后者诱导的iPS细胞形成的速度和效率远大于前者；7. HE染色结果显示了3-DNS的iPS克隆呈球形或类球形，免疫组化显示iPS克隆能够在三维支架环境中表达胚胎干细胞的特异性标记分子（Tra-1-81，NANOG，OCT4，SSEA3，SSEA4），且组蛋白H3K4甲基化程度较高，这些iPS细胞在体外能够诱导分化形成三个胚层并在免疫缺陷小鼠体内能形成具有三胚层分化的畸胎瘤。本课题研究结果显示：3-DNS能够成功诱导适用于临床的iPS细胞，且诱导生产iPS细胞的效率和速度较二维显著提高，是一种高效、安全的非病毒iPS细胞诱导新策略。