DNA-阳离子多糖-碳量子点自组装纳米粒介导的体细胞直接重编程研究

The existing methods for direct reprogramming involve viral vectors, thus limiting their clinical translation. This project constructs an efficient, safe and cell labeling multifunctional non-viral self-assembly nano gene delivery system. The main contents include the following items: Preparation of carbon quantum dots (CDs) with surface modification by cationized polysaccharides; examination of the fluorescence quantum efficiency, cytotoxicity, tracking performance, gene transfection efficiency and investigation of the delivery mechanisms using the fluorescence resonance energy transfer (FRET); Direct reprogramming of the fibroblasts into neurons by employing the single-factor (Sox2), two-factor (Ascl1 and Brn2) and a three-factor combination (Ascl1, Brn2 and Mytl1) as model genes, and evaluating the transdifferentiation speed and efficiency; Fabrication of three-dimensional (3D) tissue engineering scaffolds, observing the cell growth characteristics in the CDs-labeling 3D scaffolds, and comparing with the two-dimensional system in the aspects of neuron formation speed, transdifferentiation efficiency as well as the expression of specific factors; Establishing a rat spinal cord injury model, observing the ODs-labeled cells' migration and proliferation in the region of spinal cord injury, and assessing transplantation repairing effect resulting from the induced neurons using indicators such as the motor functions of rats' hind limbs, retrograde labeling of neurons in the cerebral cortex motor area with CDs, and the expression of related proteins. This project can provide a brand-new carrier with novel techniques and methodologies for the somatic direct reprogramming.

现有直接重编程技术因采用病毒载体而制约其临床转化，本项目以阳离子多糖-碳量子点为载体，自组装构建高效、安全、可细胞标记示踪的多功能非病毒纳米基因传递系统。主要内容包括：制备表面修饰有阳离子多糖的碳量子点，评价其荧光量子效率、细胞毒性、标记示踪性能和基因转染效率，运用FRET研究其传递机理；以单因子（Sox2）、两因子（Ascl1、Brn2）和三因子（Ascl1、Brn2、Mytl1）为模型基因将成纤维细胞直接转化为神经细胞，评价转分化速度与效率；制备三维组织工程支架，碳量子点标记示踪三维支架中细胞的生长特性，并与二维体系比较转分化速度与效率、特异因子表达等方面差异；建立大鼠脊髓损伤模型，碳量子点示踪细胞在脊髓损伤区的迁移与增殖，以大鼠后肢运动功能、碳量子点逆行标记大脑皮质运动区神经元、有关蛋白表达等指标, 评价移植修复效果。本项研究可为细胞直接重编程提供新载体、新技术、新方法。

以构建安全、高效、可视、多功能的纳米基因传递系统为目标，将成纤维细胞直接重编程为神经细胞，实现体内脊髓损伤修复。主要内容：1. 以阳离子化天然多糖为原料，水热反应一步制得荧光强度强、粒径10 nm、带正电荷、毒性小、标记性能好的球形或类球形阳离子多糖-碳量子点（CP-CDs）；2.优化CP-CDs与质粒的比例及制备工艺，制得粒径小、带正电、能有效结合质粒DNA的类球形DNA-CP-CDs自组装纳米粒，被纳米粒标记的细胞在不同激发光波长下发出红绿蓝三种荧光；3.考察了不同CP-CDs、用量、细胞数量、PH等对转染效率的影响，结果表明：CP-CDs/DNA质量比为80:1，细胞数为2×106个/mL，在ES和DF12/KSR的体系中，转染效果最佳； 4.采用FRET技术研究细胞传递机理，结果表明：DNA-CP-CDs纳米粒主要通过网格蛋白和陷穴小泡介导的内吞途径以及酶体-溶酶体系统进入细胞；5. DNA-CP-CDs纳米粒在二维体系中进行细胞转染和诱导神经分化，结果显示：纳米粒转染后14天，出现典型的神经元样形态，目的基因的相对表达含量均较高，且阳性表达Tuj1、Tau、MAP2等神经元特异蛋白；6. 研究了诱导型神经细胞的形成速度与转分化效率，结果表明：诱导时间延长，转分化效率增加，确定Ascl1+Brn2以及Brn2+Sox2+Foxa2组合诱导型神经细胞的形成速度与转分化效率较高；7. 分别采用冻干法和静电纺丝技术制备疏松多孔的胶原支架和PLGA支架，将DNA-CP-CDs 纳米粒嵌入支架冻干，接种细胞，实现细胞原位转染的同时可对支架内的神经元进行示踪；8. 研究了三维基因表达浓度、持续时间与影响因素，结果表明：降解速率适中的胶原-PLGA（1:5）共混多孔支架，接种0.8μg质粒/1×105个细胞/1×1×0.3cm3支架，较为经济合理，持续转染96h，基因转染效率最高，组合Ascl1+Brn2+Sox2在三维体系中具有较好的神经转分化效果；9. 制备了大鼠脊髓损伤模型，将诱导型神经细胞接种于凝胶支架，并植入体内治疗脊髓损伤，结果表明：诱导型神经细胞在脊髓损伤区两端进行迁移，可观察到大脑皮质切片中被碳量子点标记的神经元，诱导型神经细胞移植区域能有效表达βⅢ-tubulin、BDNF、NT-3等神经再生相关蛋白，而且大鼠后肢运动功能有明显恢复。