OsV5调控水稻叶绿体发育的机制研究

水稻温敏黄转绿突变体osv5(Osvirescent5)苗期生长在低温（20℃-24℃）条件下，叶色明显呈黄色，而在高温（26℃-30℃）条件时叶色与野生型没有明显差异。在20℃条件下，突变体的叶绿素含量和光合效率大大降低，叶绿体发育异常，类囊体垛叠层数大大减少。图位克隆结果显示OsV5编码一个具有DUF3353结构域的功能未知蛋白质，功能互补实验也验证了基因克隆的结果。有趣的是数据库检索发现此结构域不管在原核还是真核生物中均非常保守，意味着其功能的重要性。本项目将运用基因芯片和定量蛋白质组学方法分别从转录和蛋白水平分析OsV5调控叶绿体发育的途径，同时利用酵母双杂交与免疫共沉淀方法寻找与OsV5直接相互作用的蛋白质，并通过小分子RNA干扰技术研究互作蛋白的功能，阐明OsV5调控叶绿体发育的分子机理。本项目的研究结果也有助于我们理解OsV5同源蛋白在其他生物中的功能及其作用机理。

OsV5A编码AtCPP1的同源蛋白。AtCPP1在拟南芥中是单拷贝基因，而水稻基因组中有两个AtCPP1的同源蛋白，OsV5A 和OsV5B。以35S为启动子的OsV5B能够完全回复osv5a的突变表型，说明OsV5A 和OsV5B具有一定的功能冗余。 此外，OsV5A和OsV5B能够互补cpp1的突变表型。为了阐明OsV5A 和OsV5B系统发生关系，将OsV5和其它种类植物的CPP1同源蛋白进行了系统进化关系分析。结果发现单子叶类群中具有OsV5A和OsV5B两个分支，而双子叶类群中，除大豆外都只有一个CPP1同源蛋白。激光扫描共聚焦显微观察发现与黄色荧光蛋白（EYFP）融合表达的OsV5A和OsV5B定位到烟草叶肉细胞的叶绿体。进一步的免疫杂交分析发现融合蛋白主要在叶绿体的类囊体和膜部分，而不在基质部分。为了探讨温度对OsV5A和OsV5B表达的作用，对22ºC和28ºC条件下它们的表达进行了定量PCR和蛋白杂交分析。与28ºC 相比， 22ºC下 OsV5A和OsV5B的转录都增加了70%。OsV5A蛋白在22 ºC的积累大大增加，而OsV5B在28ºC的积累略有增加。 值得注意的是22ºC下，OsV5A和OsV5B蛋白在osv5a突变体中都不表达，与此同时OsPORB的蛋白表达也大大降低，这与低温下osv5a具有黄苗的表型相一致。此外，对不同生长温度下的三叶期水稻的第3叶和第4叶（茎中未抽出）中的OsV5A，OsV5B和OsPORB的蛋白表达进行分析，发现OsV5A和OsV5B的蛋白表达与生长温度和发育时期密切相关，同时OsV5A和OsV5B的表达与OsPORB表达呈正相关。为了确定OsV5A和OsV5B与OsPORB是否直接相互作用，利用酵母双杂交和双分子荧光研究发现OsV5A和OsV5B与OsPORB直接互作。最后，为了检测OsV5A和OsV5B对OsPORB是否有分子伴侣活性，对OsV5A和OsV5B抑制过氧化氢诱导的OsPORB聚集的能力进行了测定，确定它们具有分子伴侣活性。总之，极少发生在双子叶植物中的CPP1/V5基因复制使水稻和其它草本植物能够随着生理和发育的变化调控叶绿素的合成。