水稻核糖核酸酶抑制因子调控叶绿体发育的机制研究

The temperature sensitive virescent6 mutant (osv6) produces the yellow leaf at the lower temperature (22℃-25℃), but the leaf turns yellow green gradually at the higher temperature (26℃-30℃). Map-based cloning results showed that OsV6 encodes a ribonuclease inhibitor. This result was confirmed by genetic complementation experiments. The ribonuclease inhibitor belongs to a superfamily with the LRR (leucine-rich repeats) domain in eukaryotes，but their functions were unknown in plants. In this project, we will investigate the molecular mechanism by which OsV6 regulates chloroplast development at both transcript and protein levels using RNAseq and quantitative proteomics methods, respectively. At the same time, we will screen OsV6-interact proteins using yeast two hybrid and co-immunoprecipitation methods. Finally, we will analyze the function of these OsV6-interacting proteins using genetic and molecular biological approaches. Our results derived from this project will be very helpful to understand the function of the ribonuclease inhibitor in plants.

水稻温敏转绿突变体osv6在低温条件下（22-25℃）下产生黄化的叶片，高温条件下（26-30℃），叶片的叶绿素含量逐渐增加，但是仍然表现为黄绿色。图位克隆的结果显示OsV6编码核糖核酸酶抑制因子，功能互补实验也证实了图位克隆的结果。亚细胞定位分析发现OsV6特异的定位到叶绿体。核糖核酸酶抑制因子是真核生物中的一个超基因家族，具有一个亮氨酸丰富的高度重复区（leucine-rich repeats，LRR）功能域，目前它们在植物中的功能还不清楚。本项目将运用转录组学和定量蛋白质组学方法分别从转录和蛋白水平上分析OsV6调控叶绿体发育的途径，同时利用酵母双杂交和免疫共沉淀的方法寻找与OsV6直接相互作用的蛋白，并通过小分子RNA干扰技术研究互作蛋白的功能, 阐明OsV6调控叶绿体发育的分子机理。本项目的研究结果对于首次揭示植物核糖核酸酶抑制因子的功能有重要意义。

我们从辐射诱变的水稻突变体库中，筛选获得了一个温敏转绿突变体osv6。图位克隆的结果显示OsV6编码核糖核酸酶抑制因子，功能互补实验也证实了图位克隆的结果。亚细胞定位分析发现OsV6特异的定位到叶绿体。核糖核酸酶抑制因子是真核生物中的一个超基因家族，具有一个亮氨酸丰富的高度重复区（leucine-rich repeats，LRR）功能域，目前它们在植物中的功能还不清楚。将OsV6-eYFP融合表达载体在烟草叶片瞬时表达，利用GFP抗体进行蛋白免疫杂交，确定OsV6定位到叶绿体膜和类囊体，而不在基质中。定量蛋白质组学分析发现OsV6缺失主要影响光合系统II的生物学过程。以OsV6的保守序列短肽为抗原，成功获得OsV6的特异多克隆抗体。通过酵母双杂交和免疫共沉淀的方法筛选到4个与OsV6互作的蛋白，并进行了BIFC验证。OEEP1和FHY3参与活性氧调控途径，CBD和DIP1相关功能未见报道。对4个互作蛋白的亚细胞定位分析发现，它们定位到叶绿体的膜，类囊体或基质。我们构建4个基因的敲除载体，创建功能缺失突变体。同时，分别将4个基因在v6突变体中过表达，分析它们与OsV6的遗传关系。以上研究结果说明OsV6可能通过直接互作的方式调控OEEP1和FHY3的表达，影响ROS途径和光合系统II的的建成，进而调控叶绿体的发育。