m6A甲基转移酶复合体重要组分KIAA1429在小鼠卵泡发育过程中的作用及机制研究

Follicular development directly affects the quantity and quality of oocytes, and is very important for the maintenance of female fertility. N6-methyladenosine (m6A) is the most prevalent mRNA chemical modification in eukaryotes and has a wide variety of effects on the post-transcriptional regulation of mRNA. Kiaa1429 is an oocyte enriched gene we screened from the DBTMEE database (http://dbtmee.hgc.jp/). Recently, it has been confirmed that KIAA1429 is one of the key components of the m6A methyltransferase complex. Our previous study found that oocyte-specific knockout of Kiaa1429 caused completely infertile in female mice, ovarian follicles in the secondary and subsequent stages significantly reduced. The aim of this project is to further explore the influence of Kiaa1429 deletion on the process of follicle development, in-depth discuss the specific mechanism that KIAA1429, as an important m6A modification regulatory protein, affects the post-transcriptional regulation of mRNA and thus plays an important role in the process of follicular development. This study will deepen the understanding of the precise regulation mechanism of follicular development from the view of RNA methylation modification and is expected to provide a new perspective for the diagnosis and treatment of female infertility caused by follicle development disorder.

卵泡发育情况直接影响卵母细胞的数量和质量，对于雌性生育力维持十分重要。6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)是真核生物中最普遍的mRNA修饰形式，对RNA的转录后调控产生广泛多样的影响。Kiaa1429是我们从DBTMEE数据库中筛选到的一个卵细胞优势表达基因，已有研究证实其为m6A甲基转移酶复合体的重要组分之一。我们的前期研究发现卵母细胞特异性敲除Kiaa1429的雌性小鼠完全不孕，卵巢中次级及以后阶段的卵泡明显减少。本项目拟对Kiaa1429卵母细胞特异性敲除小鼠进一步分析，明确KIAA1429缺失影响卵泡发育的具体环节；深入探讨KIAA1429作为m6A修饰调节蛋白，通过影响RNA转录后调控从而在卵泡发育过程中发挥作用的具体机制。本研究将加深对卵泡发育精确调控机制的理解，并有望为卵泡发育障碍所致女性不孕的诊治提供全新视角。

Kiaa1429是本实验室前期在DBTMEE数据库中筛选到的一个卵母细胞优势表达基因，已有研究证实其为m6A甲基转移酶复合体的重要组分之一。在前期研究中我们发现，Kiaa1429在GV期卵母细胞优势表达并随年龄增长呈上调趋势，免疫荧光染色结果显示其在GV期卵母细胞细胞核中呈弥散性点状分布。我们构建了Kiaa1429卵母细胞特异性敲除(Kiaa1429Zp3cKO)小鼠，初步发现雌性小鼠完全不孕，成年雌鼠卵巢中次级及以后阶段的卵泡明显减少。在此基础上本项目着重研究了KIAA1429在小鼠卵泡发育过程中的具体作用及机制。结果表明，Kiaa1429Zp3cKO小鼠卵泡中颗粒细胞增殖能力下降而凋亡信号增强，卵母细胞超数排卵后体外成熟能力显著下降。EU掺入实验和大规模转录组测序结果均提示KIAA1429缺失影响了细胞质中的RNA代谢和卵母细胞成熟过程。进一步我们对其机制进行探讨，结果表明KIAA1429缺失影响了卵母细胞中的m6A水平，RNA-seq数据提示其一方面参与了卵母细胞成熟和卵泡发育相关基因的表达和可变多聚腺苷酸化（APA）调控；另一方面,除APA之外，我们发现KIAA1429与核散斑内的剪接因子SRSF3共定位并调控卵母细胞内的剪接过程，但免疫共沉淀实验结果表明两者并不直接结合，根据文献报道我们关注到m6A阅读蛋白YTHDC1对于SRSF3的招募作用，免疫荧光实验结果证明KIAA1429的缺失确实导致YTHDC1和SRSF3在核内定位的减少，对RNA-seq数据中可变剪接事件进行差异分析，结果显示KIAA1429参与了卵母细胞中mRNA可变剪接的大规模调控，其缺失导致大量基因发生外显子包含，并可通过影响相关基因的剪接调控影响卵细胞成熟过程。综上，本研究证实了KIAA1429作为m6A修饰的重要调节蛋白，主要通过影响可变剪接这一RNA转录后调控事件从而调控卵泡发育和卵母细胞减数分裂成熟过程，有助于深入了解卵泡发育和卵母细胞成熟的精确调控机制，探明卵泡发育/卵母细胞成熟障碍所致女性不孕发生的原因，并有望为相关女性不孕的临床诊疗提供全新的视角。