母源因子Rnf114在小鼠早期胚胎中的功能研究

Rnf114蛋白从本实验室构建的小鼠卵母细胞蛋白表达谱中筛选得到，该蛋白目前尚缺乏明确功能报道。 其表达信息显示，Rnf114 mRNA在卵细胞及受精卵中特异高表达，卵裂后表达量显著下降并在早期胚胎中维持较低的表达水平；免疫荧光的结果显示，Rnf114蛋白自小鼠GV期卵母细胞到囊胚阶段持续表达，表达量没有明显改变。前期预研结果初步显示，在合子中干扰Rnf114表达后，囊胚形成率及囊胚细胞数呈下降趋势，以上结果提示我们Rnf114作为一个母源因子在早期胚胎发育过程中发挥重要作用。结构域分析及预研结果高度提示该蛋白具有E3泛素连接酶活性，同时该蛋白还可能通过与其它蛋白相互作用发挥功能。本研究拟运用受精卵siRNA片段显微注射、胚胎移植等技术研究Rnf114在早期胚胎发育过程中的作用。同时运用大规模的蛋白芯片等策略，筛选Rnf114在早期胚胎中调控的下游底物及与之结合的蛋白，以阐明其作用机制。

RNF114蛋白是从本实验室构建的小鼠卵母细胞蛋白表达谱中筛选得到的, 对其在卵母细胞及植入前早期胚胎中的表达研究提示,该蛋白作为一个母源性因子在早期胚胎发育过程中发挥作用。在本项目的支持下，我们对该蛋白在早期胚胎中的作用及其作用机制展开了深入探讨。我们通过向合子中显微注射Rnf114的特异性siRNA片段敲低其表达，结果显示早期胚胎发育明显受阻于2细胞阶段，证实了RNF114确实在植入前胚胎发育过程中发挥作用。目前，对于RNF114的生物学功能还知之较少，结构域分析及现有的研究结果提示，该蛋白具有E3连接酶活性，我们的研究结果也进一步证实了这一点，在体外泛素化实验中加入野生型的RNF114可形成多聚泛素链,而加入突变型的RNF114则不能。此外、我们利用在体外泛素化体系中加入不同赖氨酸位点突变的泛素分子，证明了RNF114参与由K11、K27、K48介导的多聚泛素链形成，提示其可以导致底物蛋白的降解。进一步我们利用Invitrogen ProtoArray蛋白芯片筛选得到了RNF114的10余种潜在底物，接下来将底物蛋白的表达质粒与Rnf114共转染的实验以及体外底物依赖的泛素化实验结果证明了其中4种蛋白—CD74, TAB1, TNIP1和RALGPS1为RNF114的底物，RNF114可导致这4种蛋白质的泛素化降解。 随后，我们通过向合子中注射外源性mRNA过表达这四种蛋白质，结果显示在过表达TAB1蛋白后得到了与Rnf114敲低类似的表型，早期胚胎发育受阻于2细胞阶段，进一步、我们在敲低Rnf114的同时敲降Tab1，进行rescue实验，结果显示rescue实验可部分挽救2细胞发育阻滞的表型。以上结果充分说明，RNF114作为一个母源性的E3连接酶，通过介导TAB1的降解在早期胚胎发育过程中发挥重要作用。