miRNA-31在鸡卵泡发育过程中的调控作用及机制研究

鸡卵泡发育状态和潜能直接影响到鸡的产蛋性能。已有报道证实微小RNA（miRNA）直接或间接参与了动物卵泡颗粒细胞增殖、分化和闭锁的调控。尽管目前已在鸡上发现了大量的miRNAs，但有关miRNAs在鸡卵泡过程中的调控研究鲜见报道。本项目以鸡卵泡为实验材料，拟采取激素诱导鸡卵泡颗粒细胞培养、生物信息学分析、stem-loop qRT-PCR等技术对我们前期工作中筛选出的gga-miRNA-31进行差异表达分析、靶基因预测及细胞水平的功能验证；应用miRNA基因沉默技术、荧光定量PCR、Western blot、荧光素酶活性分析和MTT法结合流式细胞技术分析细胞活性等方法研究miRNA对鸡卵泡发育的调控机制。初步阐明鸡卵泡发育过程可能涉及miRNA调控，为今后鸡的分子育种提供新的方法和途径而奠定理论基础。

鸡卵泡发育状态和潜能直接影响到鸡的产蛋性能。已有报道证实微小 RNA（miRNA）直接或间接参与了动物卵泡颗粒细胞增殖、分化和闭锁的调控。本项目以鸡卵巢和卵泡为实验材料，利用芯片和测序技术结合生物信息学分析,探究了母鸡生殖发育过程中miRNAs和相关基因mRNA表达模式;同时采用体外培养鸡卵泡颗粒细胞,并经促卵泡素(FSH)诱导,研究了FSH介导鸡卵泡颗粒细胞凋亡过程中差异表达的miRNAs及其表达模式。本项目研究结果如下：.1．.产蛋母鸡与卵巢发育障碍母鸡卵巢差异表达的miRNAs研究.在蛋鸡生产中，卵巢发育对健康卵泡和优势卵泡的发生很重要，但在相同日龄的母鸡中，有些鸡只存在卵巢发育不全或是功能障碍，使得在卵巢上未能发育成各类小卵泡。本研究采集240日龄产蛋母鸡与卵巢发育障碍母鸡（从未产蛋鸡只）卵巢组织，利用免疫细胞化学、miRNA测序技术和Real-time PCR，研究了两类卵巢miRNAs表达差异。结果显示，差异表达miRNAs共有34个，其中产蛋鸡卵巢比不产蛋鸡卵巢，上调miRNAs有6个，下调miRNAs有28个；其中表达量最高的miRNA 是gga-miR-10b FPKM值高达5153870，其余还有18个miRNAs的FPKM值都大于10000. 这些高表达miRNAs 暗示了miRNAs可能在鸡卵巢发育过程中发挥重要的功能。.2．鸡胚胎期卵巢发育表达模式研究. 将上述差异miRNAs进行靶基因预测分析并进行KEGG富集分析，结果显示，卵巢发育存在内的遗传机制，因此，我们采用表达谱芯片分别检测了鸡胚胎期E5.5、E12.5、 E15.5 和E18.5 的卵巢组织样的mRNA表达水平。结果显示，与E5.5相比，E12.5、 E15.5 和E18.5卵巢组织中分别存在4448, 6184和 1139个基因上调，同时分别有4595, 5629和 1321个基因下调。这些差异基因经GO分析显示，大多数基因与视黄酸代谢和激素合成等生物过程有关。.3．FSH介导鸡卵泡颗粒细胞过程中差异表达的miRNAs研究.采用原代培养鸡卵泡颗粒细胞, 用卵泡刺激素（FSH）进行处理36小时后，获取实验组及对照组颗粒细胞，应用流式细胞术进行颗粒细胞凋亡检测, 应用高通量测序技术筛选FSH介导鸡卵泡颗粒细胞过程中差异表达的miRNAs，qRT-PCR对表达差异显著的mi