基于APP-appoptosin通路及体内过程的土黄芪抗老年痴呆药效物质及其作用机制研究

Appoptosin, a novel proapoptotic protein, is an important factor between two alzheimer's related proteins-Aβ and Tau. Based on the research platform of previously accomplished project, the extracts and related fractions of Yi-Qi-Bu-Xu herb-Ficus hirta Vahl exhibited preferable anti-alzheimer's effects by the multi-targeted activity evaluation system of APP-appoptosin pathway. On this basis, this study taking the early recognition of components in blood and brain as a guide to determine the active group of clusters, then prepare the active fractions in vitro and conduct the research of their chemical constituents, study the anti-alzheimer's mechanism of active material by the activity evaluation system of APP-appoptosin pathway and explore the synergy of different compositions between multiple targets by establishing active ingredient-AD target network diagram. At the same time, using the unique precise-and-thorough background-subtraction (PATBS) analysis technology to explore the metabolic changes of active monomers or components in mice and obtain the metabolic profile of compounds in vivo, in order to clarify the in vivo efficacy material basis and functional mechanism of Ficus hirta Vahl against alzheimer's diseases.

新的促凋亡蛋白Appoptosin是与老年痴呆症密切相关的Aβ和Tau蛋白之间的重要因子。借助前期已经结题项目的研究平台，申请人利用APP-appoptosin通路的多靶点活性评估体系，发现具有益气补虚功效的中药土黄芪的提取物及相关馏分，均显示了较好的抗老年痴呆活性。在此基础上，本课题通过以其入血入脑成分的早期识别为指导，确定活性物质所在活性组分群，并在体外大量制备活性组分的基础上进行相应的化学成分研究；通过APP-appoptosin通路活性评估体系，研究活性物质的体外抗老年痴呆作用机制，建立活性成分-AD靶点网络图，探讨不同成分之间的协同作用。同时，进一步利用独特的精确而彻底的背景扣除（PATBS）分析技术，鉴定活性单体或组分在小鼠给药后入血入脑成分的代谢变化，获得化合物在体内的代谢轮廓，以期阐明土黄芪抗老年痴呆的体内药效物质基础及其作用机制。

土黄芪（五指毛桃）为桑科榕属植物粗叶榕的根。研究表明土黄芪的化学成分主要为苯丙素类、木质素类类、香豆素类、黄酮类、三萜类、甾体类、蒽醌和酚酸类等。现代药理学研究表明土黄芪具有广泛的药理活性。目前关于土黄芪的化学成分及药理活性研究不够全面，限制了其药效物质的阐明。本项目利用LC-MS技术，从大鼠土黄芪灌胃给药后的血清中获得24个入血成分，并鉴定了其中12个入血成分的结构。利用多种色谱及波谱学方法从土黄芪60%乙醇提取物中分离鉴定102个化合物，其中新结构化合物14个，新天然产物1个。.化合物的生物活性研究表明：化合物38能下调Aβ、BACE1和Appoptosin蛋白的表达；化合物34和35能明显下调Aβ、APP-β-CTF和Appoptosin蛋白的表达。化合物1和11能抑制神经细胞p-JNK，p-ERK和p-AKT的表达，11还能浓度依赖性地抑制p-p65的表达，显示了这些化合物靶向APP-Aβ通路及神经炎症通路的抗老年痴呆活性。此外，化合物31能诱导HeLa细胞凋亡并上调cleaved-PARP、p-p38、p-JNK和下调caspase 3、p-AKT、p-ERK的表达。化合物65能诱导HepG2细胞凋亡并上调p-p38和p-JNK的表达；化合物72能诱导HeLa细胞并明显上调cleaved-PARP、Bax、p-p38、p-JNK以及下调p-AKT、p-ERK的表达。进一步的核受体RXRα双报告基因及互作研究结果表明，19个化合物可以拮抗9-顺维甲酸激活的RXRα的转录活性，其中化合物31体现出与核受体RXRα有较好的结合能力。化合物对肿瘤细胞凋亡的作用机制研究，可以为土黄芪治疗老年痴呆的药效物质研究提供更多的视角。.本项目对土黄芪的入血成分，化学成分以及生物活性进行了较为全面系统的研究，更好的阐明了土黄芪的药效物质基础，为土黄芪的进一步开发利用提供了科学依据。