肝细胞源性MANF在利福平诱导肝适应性反应中的作用及其机制研究

Induction of adaptive response in the liver by antituberculosis drugs is an important research direction in the field of drug-induced liver injury. Our preliminary study confirmed that the PERK pathway of unfolded protein response (UPR) mediated rifampicin induced adaptive response in vitro, and at the same time, we also observed that rifampicin induced secreted protein MANF expression changes, but the role is unknown.This subject was proposed: rifampicin activates UPR, and induce the expression of hepatocyte derived MANF changes, which keeps UPR at a proper level, resulting in the adaptive protection. We proposed the dynamic observation of the serum MANF expression and MANF mRNA of peripheral blood from patients of rifampicin induced adaptive response in the liver, established rifampicin induced adaptive response of MANF-LKO murine model, MANF knockout L02 cells, and MANF knockout HepG2 cells, and using the methods of over expression of MANF, deeply discuss the impact of MANF on the severity of liver injury and UPR protein and gene expression. These results will provide in-depth understanding the mechanism of rifampicin induced adaptive response in the liver, and provide theoretical and experimental basis for reasonable treatment, which has important clinical value.

抗结核药物诱导肝脏产生适应性反应是药物性肝损伤领域中重要的研究方向。我们前期的体外研究发现未折叠蛋白反应（UPR）中的PERK通路介导了利福平诱导的适应性反应，同时发现分泌型蛋白MANF的表达也发生改变，但作用不明。本课题提出：利福平激活UPR后，诱导肝细胞源性MANF的表达增加，MANF使UPR维持在合适的程度，从而产生适应性保护。为此我们拟动态观察利福平诱导肝适应性反应患者血清MANF及外周血白细胞（PBWC）MANF mRNA的表达，采用肝脏特异性MANF敲除（MANF-LKO）B6J小鼠和MANF敲低L02细胞、MANF敲低HepG2细胞建立利福平诱导适应性反应模型，以及采用MANF过表达的方法，深入探讨MANF对肝损伤严重程度和UPR相关蛋白、基因表达的影响。此研究将为深入认识利福平诱导肝适应性反应机制及合理治疗提供新的理论和实验依据，具有重要的临床价值。

抗结核药物导致药物性肝损伤适应现象是药物性肝损伤领域中令人感兴趣的研究方向。适应现象约占全部抗结核药所致药物性肝损伤患者总数的10%-15%，识别适应现象应的意义在于避免不必要的停药，而目前对于适应的具体机制尚知之甚少。因此，需要建立合适的模型开展研究，以深入了解抗结核药诱导适应现象的变化规律及其机制，为科学合理地指导临床用药提供依据。.申请人课题组先期研究发现，利福平所致肝损伤模型有适应性变化的现象，但分子机制尚未完全阐明。本课题进一步研究发现，中脑星形胶质细胞源性神经营养因子（MANF）作为一种内质网应激诱导蛋白，在利福平诱导的肝损伤中起保护作用。对利福平致胆汁淤积性肝损伤小鼠肝/体比值及血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆汁酸（TBA）、总胆红素（TBIL）和直接胆红素（DBIL）水平进行测定，发现显著升高。同时在肝损伤小鼠中MANF蛋白和mRNA水平显著升高。在肝细胞特异性MANF基因敲除（HKO）小鼠中，治疗后检测到肝/体比和血清ALT、AST、ALP、TBA、TBIL和DBIL水平的额外增加。此外，重组人MANF（rhMANF）治疗可有效降低RFP诱导的肝损伤小鼠的肝/体比值和血清ALT、AST、ALP、TBA、TBIL和DBIL水平。此外，我们发现TUNEL染色显示HKO小鼠肝组织中凋亡细胞增多。同时检测C/EBP同源蛋白（CHOP）、Ki67和增殖细胞核抗原（PCNA）的蛋白水平和Ki67的mRNA水平在利福平治疗组明显升高，且这些指标的升高程度在肝细胞敲除组明显高于野生型对照组。rhMANF治疗可挽救细胞凋亡，降低MANF缺失和利福平引起的CHOP、Ki67和PCNA的蛋白和mRNA水平。在HKO小鼠中，免疫球蛋白重链结合蛋白（BIP）和活化转录因子4（ATF4）在利福平治疗后显著增加，rhMANF治疗后降低。因此，我们认为肝细胞源性MANF是通过抑制ATF4-CHOP信号激活和随后的细胞凋亡保护利福平诱导的胆汁淤积性肝损伤。