基于Keap1-Nrf2介导的系膜细胞收缩调节探讨芪箭颗粒改善晚期糖尿病肾病健存肾单位滤过功能的作用机制

As the most important microvascular complication of diabetes, diabetic nephropathy (DN) is the leading cause of end-stage renal disease. When DN progress to glomerular filtration rate less than 60ml/min/1.73m2, there will be a progressive decline in renal function. Retaining the filtration rate of residual kidney is essential for delaying the progression of DN. Qi Jian granule is a compound Chinese herbal preparation with effect of promoting Qi, nourishing yin and activating blood circulation. The GFR of early DN patients treated with Qi Jian granule can be significantly improved in a multi-center randomized controlled trial. Animal experiments displayed that Qi Jian granule could improve renal pathological change and alleviate oxidative stress injury in the kidney. Nuclear factor E2 related factor 2 (nuclear factor erythroid-2 related factor 2, Nrf2) is a key transcription factor regulating the endogenous antioxidant pathway. Activated by oxidative stimulating factors, Nrf2 translocates into the nucleus, subsequently induces the transcription of a variety of antioxidant genes, and ultimately improves the anti-oxidative ability of tissue. Activation of Nrf2 can increase GFR in patients with overt DN. The mechanism may be related to regulating transient receptor potential canonical 6 (TRPC6) mediated mesangial cell contraction to regulate renal blood flow and glomerular filtration area. The objectives of this study is to observe the improvement of GFR on late stage DN with Qi Jian granule treatment via in vivo and in vitro experiments, and to explore the involvement of Keap1-Nrf2 mediated mesangial cell contraction.

糖尿病肾病(DN)作为糖尿病的主要微血管并发症，是终末期肾病的重要病因。当DN进展至肾小球滤过率(GFR)小于60ml/min/1.73m2时，肾功能将进行性下降，维持健存肾单位滤过率是延缓疾病进展的重要思路，也是亟待解决的治疗难点。芪箭颗粒是具有益气养阴活血功效的中药复方，多中心临床试验证实可提高早期DN患者GFR，动物实验表明能够改善肾脏病理、减轻氧化损伤。核因子E2相关因子2(Nrf2)是调控内源性抗氧化信号通路的核心转录因子，在氧化损伤因素刺激下转移入核，启动多种抗氧化基因转录，提高细胞抗氧化应激能力。激活Nrf2可升高DN晚期患者GFR水平，机制可能与调控瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(TRPC6)介导的系膜细胞收缩，从而调节肾血流量和肾小球滤过面积有关。本研究拟借助体内外实验观察芪箭颗粒对晚期DN的GFR改善情况，并以Keap1-Nrf2介导的系膜细胞收缩功能调节探讨其潜在机制。

芪箭颗粒（又名糖肾方）是李平教授根据名老中医经验及多年的临床实践拟定的治疗糖尿病肾病（DN）的中药复方制剂。本研究借助体内外实验观察芪箭颗粒对DN的改善情况，并以Keap1-Nrf2介导的系膜细胞收缩功能调节探讨其潜在机制。首先建立单侧肾切除合并STZ注射诱导的DN大鼠模型，分为模型组，芪箭颗粒低、中、高剂量组，福辛普利钠组，另设假手术组，连续给药20周。结果示芪箭颗粒组尿白蛋白/肌酐、血肌酐、尿素氮较模型组显著降低，肾小球系膜基质增生、肾小管损伤、肾间质纤维化减轻。芪箭颗粒组大鼠肾组织SOD含量显著升高，而MDA含量下降，抗氧化能力明显提高；肾皮质Keap1基因和蛋白表达下调，上Nrf2及其下游抗氧化分子H01、TXNRD1、GCLC表达上调。以上结果证实了芪箭颗粒可通过Keap1-Nrf2通路发挥其抗氧化应激作用，减轻DN大鼠的肾脏病理损伤。我们进一步分离大鼠肾小球，以血管紧张素Ⅱ刺激其收缩，再加入芪箭颗粒含药血清共培养，结果显示芪箭颗粒可明显增大肾小球体积，验证了芪箭颗粒可调节肾小球系膜细胞收缩功能的假说。我们采用高糖诱导的大鼠系膜细胞（HBZY-1）氧化损伤模型，其TRPC6表达显著上调，细胞内钙离子浓度明显升高，而加入TRPC6抑制剂2-ABP后细胞收缩程度及钙离子浓度明显下降。进一步将Nrf2过表达的重组质粒转染至HBZY-1细胞，TRPC6表达下调，细胞内钙离子浓度下降。验证了TRPC6相关的Ca2+内流参与了氧化应激时系膜细胞的收缩，且该作用受到Nrf2信号通路的调节。最后采取含药血清干预该细胞模型，可下调Keap1、TRPC6，上调Nrf2及H01、TXNRD1、GCLC的基因及蛋白表达，有效降低细胞ROS及Ca2+水平，该效应可被Nrf2基因敲降所抑制。阐明了芪箭颗粒的肾脏保护作用是通过干预Keap1-Nrf2信号通路从而调节系膜细胞收缩实现的。此外，我们还通过网络药理学方法，筛选出芪箭颗粒治疗氧化应激损伤的有效成分和作用通路，其中Keap1、Nrf2、HO-1及SOD为其重要靶点，印证了本研究的科学性和重要性。本研究丰富了芪箭颗粒治疗DN的科学内涵，完善了其抗氧化的分子机制，为未来开展更深入、更精准的研究奠定了基础。