参芪膜肾颗粒调控补体调节蛋白修复受损肾小球足细胞的研究

膜性肾病属难治性肾病，病理主要表现为肾小球上皮细胞（足细胞）下弥漫性免疫复合物沉积。补体系统激活，产生C5b-9，导致足细胞损伤是发病的关键。.我们既往的研究表明参芪膜肾颗粒具有较好的临床疗效，并可能通过免疫调节发挥作用。在此基础上，本课题采用国际公认的Heymann模型，通过SELDI-TOF质谱和蛋白芯片观测补体调节蛋白和补体C5b-9的表达，免疫病理学观测肾组织中IgG和补体C5b-9的免疫荧光强度，电镜观察足细胞形态，免疫组化法计算足细胞数量，实时荧光PCR测定nephrin 、podocin、podoplanin的mRNA以比较足细胞功能，以期证实参芪膜肾颗粒是通过调控补体调节蛋白，抑制激活的补体系统，从而减少C5b-9，修复受损的足细胞。探讨参芪膜肾颗粒的免疫调节及对足细胞的保护机制，为膜性肾病的中医药治疗提供确切靶点，为分析"益气活血化湿法"与免疫调节之间的内在联系提供思路。

背景目的：观察参芪膜肾颗粒对膜性肾病大鼠的疗效，探讨其对足细胞保护方面的作用，以及该作用是否与调控补体调节蛋白有关。内容方法：利用大鼠PHN模型进行动物实验。将30只SPF级雄性SD大鼠随机分成10只空白对照组和20只造模组，造模成功后将20只造模SD大鼠随机分成模型组、治疗组，每组各10只。其中治疗组予每日一次性灌服参芪膜肾颗粒，共治疗4周。于治疗前（0周后）、2周后、4周后留取24小时尿，测定各组大鼠24小时尿蛋白定量、并测定处死前的血浆白蛋白、血肌酐、尿素等。治疗结束后处死大鼠留取肾组织行光镜、免疫荧光及电镜检测，WT1免疫组化染色，行RT-PCR检测肾组织Podocin、Podocalyxin和Nephrin的mRNA表达量。相关蛋白质谱比较治疗前后治疗组与模型组包括补体调节蛋白在内的24小时尿蛋白的差异情况。结果：经治疗后治疗组大鼠的24小时尿蛋白及血浆白蛋白较模型组均有明显改善。一般病理形态学损伤程度亦较模型组略有减轻。但免疫荧光检测治疗组与模型组的IgG和C3的荧光强度无明显差异。电镜下发现治疗组大鼠的GBM增厚、足细胞足突融合消失及上皮下免疫复合物沉积程度较模型组有较明显减轻。WT1免疫组化染色发现治疗组大鼠的足细胞核染色面积比较模型组升高，提示足细胞数量减少程度比模型组有所好转。RT-PCR检测发现经治疗组大鼠Podocin、Podocalyxin的mRNA表达量较模型组明显增高，但Nephrin的mRNA表达量各组尚未见明显差异。相关蛋白质谱检测发现了248种差异表达蛋白，其中包含补体调节蛋白Clusterin、白蛋白、补体成分C3、C4、C5、C9及抗体IgG。治疗组治疗后的白蛋白、C3、C4、C5、C9及IgG均得到下调且明显低于模型组，而补体调节蛋白Clusterin上调较模型组亦更明显。科学意义：参芪膜肾颗粒能从一定程度上缓解PHN大鼠足细胞数量减少、足突融合、GBM增厚等病理损伤的足细胞保护作用，并能降低患病大鼠的24小时尿蛋白、提高血浆白蛋白。其机制可能与该药可以下调IgG抗体及补体成分C3、C4、C5和C9抑制免疫复合物形成及补体系统过度活化，促进补体调节蛋白Clusterin上调而抑制C5b-7的形成以及上调足细胞功能蛋白Podocin和Podocalyxin的表达有关。