地黄毛蕊花糖苷生物合成的分子调控机制研究

Acteoside, which is one of the major bioactive constituents in Rehmannia glutinosa L., has extensive biological activities including antioxidant, immunoregulation, anti-inflammatory, and hepatoprotection. However, the accumulation and biosynthesis of acteoside have not been thoroughly investigated. In this project, we are going to detect acteoside contents in different tissues including tuberous, stem, leaf, flower and fruit from low- and high-acteoside germplasms by HPLC. In order to screen differentially expressed genes on acteoside biosynthesis, leaf and tuberous root of plants will be collected each from the two kinds of germplasms when acteoside contents showed the biggest difference as fresh samples for RNA-seq. At the same time, leaf and root of seedlings hydro cultured in 1/4 MS liquid medium will be harvested after treated by suitable concentration of elicitor. We will determine the candidate key enzyme and transcription factor genes in regulation of acteoside biosynthesis from the differentially expressed genes by detecting their expression profile in process of acteoside biosynthesis and in response to elicitor stimulation using real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) technology. Several candidate genes will be selected to investigate their in vivo molecular functions in regulation of acteoside biosynthesis by Agrobacterium mediated transformation. This project will preliminarily interpret the molecular mechanisms of acteoside biosynthesis in Rehmannia glutinosa, lay foundations for quality control of Rehmannia glutinosa, development of new drugs with acteoside, and realize the heterologous production of synthetic biology.

毛蕊花糖苷是药用植物地黄的主要活性成分之一，具有抗氧化、免疫调节、抗炎、保肝等生物活性，其积累规律和生物合成分子调控机制并不清楚。本项目拟以毛蕊花糖苷含量差异的地黄种质为材料，以HPLC法检测道地产区生长周期内块根、茎、叶片、花和颖果等组织毛蕊花糖苷积累的时空变化规律。在毛蕊花糖苷含量差异最大的时期，分别采集毛蕊花糖苷含量高和低的地黄种质叶片和块根的鲜样进行转录组测序，同时收集诱导子处理的水培地黄叶和根进行转录组测序，筛选调控地黄毛蕊花糖苷生物合成的关键酶和转录因子。以实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析其在地黄毛蕊花糖苷生物合成中的时空表达模式，以及在地黄水培过程中响应诱导子刺激的表达特性，确定候选的关键酶和转录因子基因。通过遗传转化对候选基因进行功能验证。以期初步阐明地黄毛蕊花糖苷生物合成的分子机制，为地黄的品质控制、毛蕊花糖苷新药的开发及实现合成生物学的异源生产奠定基础。

毛蕊花糖苷是一种苯乙醇苷类成分，具有多种药理活性，是地黄质量控制的指标性成分之一，但其积累规律和分子合成机理并不清楚。课题组分析了地黄毛蕊花糖苷的积累特征，发现苗期地黄叶片毛蕊花糖苷含量高，块根含量低，嫩叶较展开叶和老叶含量低，不同生长期的叶片和块根中毛蕊花糖苷积累呈波动分布，年份间表现不一致，但含量高低与基因型有关。块根中菊花心部位含量低于非菊花心。建立了地黄毛状根诱导体系，筛选出水杨酸为促进毛蕊花糖苷积累的诱导子，25 μmol/L的水杨酸能够使毛蕊花糖苷含量提高到对照的2.3倍。毛蕊花糖苷在遮阴后的叶片中含量降低，块根中含量升高。推导优化了地黄毛蕊花糖苷生物合成途径，鉴定了相关的10个催化酶的多个编码基因。选取水杨酸诱导地黄毛状根，应用毛蕊花糖苷含量不同的材料，地黄的菊花心与非菊花心部位，遮阴后的地黄叶片和块根，利用转录组测序，获取差异表达的基因，揭示了地黄毛蕊花糖苷积累的分子特征和地黄质量形成的机制，应用实时荧光定量PCR技术进行验证并锁定关键的候选基因。鉴定了40个地黄MYB转录因子家族基因和36个中介体亚基基因，分析了它们的蛋白质结构及时空表达模式，以及响应诱导子处理、逆境胁迫时的表达特征，获得了8个中介体亚基基因RNAi植株，初步分析了它们在模拟连作水培条件下的表型。克隆了RgTyDC、RgEXPA10和RgUGT2等多个候选基因，分析了它们的基因组结构和蛋白质特征，并应用遗传转化对RgUGT2的分子功能进行了研究，获得了RgUGT2的过量表达的毛状根系和再生植株，其毛蕊花糖苷含量显著高于没有转基因的对照，明确了RgUGT2是毛蕊花糖苷生物合成途径的关键催化酶基因。综上，研究基本达到了预期目标，明确了地黄毛蕊花糖苷的积累规律，筛选出水杨酸是毛蕊花糖苷积累的诱导子，鉴定了地黄毛蕊花糖苷的催化酶基因，筛选出部分与毛蕊花糖苷积累呈正相关的候选基因，明确了RgUGT2分子功能，为应用栽培措施和育种手段调控地黄毛蕊花糖苷的含量提供依据，也为进一步解析地黄毛蕊花糖苷的分子调控网络奠定基础。