生态因子调控蒙古黄芪毛蕊异黄酮及其糖苷合成积累的分子机制

. In order to realize the standardized quality control for traditional Chinese medicine, it is very important to understand the metabolic pathways of synthesis and accumulation of medicinal compositions in plants and the influences of ecological factors. Calycosin and its glucoside are two typical compounds determining the quality of medicinal plant Mongolian astragalus (Astragalus membranaceus Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao). However, there is no systematic study of the calycosin pathway, leading to no proper approach to realize accurate quality control of calycosin for its unstable contents in the plants. Our preliminary work showed that low-temperature treatment and appropriate ultraviolet radiation are critical to promote the synthesis of calycosin and its glucoside. Centered on the calycosin metabolic pathways in Mongolian astragalus, this project will clone the key genes in the pathways and study their biological functions; explore the regulation mechanisms of the ecological factors which affect the isoflavonoid contents and differential expression of key genes; and identify promoters and miRNAs targeting the key genes in the pathways and further clarify the mechanism of differential expression of key genes. Finally, these studies will provide a scientific basis for planting and cultivation of Mongolian astragalus medicinal plants, guaranteeing the quality maintenance of Mongolian astragalus.

药用成分在植物体内的合成与积累过程受其代谢途径及生态因子的影响，有效地控制这些物质的合成积累是实现中药质量标准化控制的关键环节。毛蕊异黄酮及其糖苷是衡量蒙古黄芪质量中两个标志性化合物，由于缺乏对其合成代谢过程及生态因子影响的深入研究，造成蒙古黄芪质量控制的困难。在我们前期研究中，发现低温处理和适量的紫外辐射是促进毛蕊异黄酮及其糖苷合成的重要因子。本项目将以该有效成分的合成代谢途径为主线，寻找控制代谢途径的关键基因并进行其生物学功能研究；通过改变一些生态因子，获得蒙古黄芪异黄酮类化合物的合成积累变化与关键基因差异表达的关系，阐明生态因子在该有效成分合成积累过程中的调控作用。在此基础上，我们将寻找可能作用于代谢途径关键基因的启动子/miRNA，探讨调控关键基因差异表达的分子机制。这些研究将为稳定和控制黄芪药材的质量提供科学依据，还可望为利用植物基因工程技术提高蒙古黄芪的品质打下分子基础。

蒙古黄芪是多年生豆科草本植物， 异黄酮类化合物如毛蕊异黄酮（calycosin）及其糖苷（calycosin glucoside）常作为衡量蒙古黄芪质量中两个重要的标志性化合物，具有广泛的生理和药理活性。本项目主要研究成果如下：.1. 克隆了蒙古黄芪毛蕊异黄酮代谢途径中的关键基因并进行功能活性研究： 毛蕊异黄酮及其糖苷的合成代谢途径属于黄酮代谢途径的一个重要分支。本研究中,通过对查尔酮异构酶（AmCHI）分析，发现了4个候选的活性氨基酸位点。利用定点突变和精确定量的酶活测定， 验证了这4个氨基酸(Glu107、Arg110、Tyr154和Tyr197)具有催化活性，并阐明这4个活性氨基酸可能的催化作用机制；蒙古黄芪的异黄酮合酶（AmIFS）和异黄酮-2’-羟化酶（AmI2’H）属于植物P450家族蛋白，外源表达非常困难。我们克隆了AmIFS和AmI2’H全长cDNA，并对AmIFS和AmI2’H的ORF区进行合理改造，构建到pCW和pET28质粒上，优化表达条件获得了可溶性的AmIFS和AmI2’H蛋白，具有酶催化活性功能。.2. 研究光照周期对蒙古黄芪异黄酮类化合物的合成积累变化：光照周期能够强烈的影响植物细胞生长及次生代谢产物积累，是重要生态因子之一。本研究采用长短两种光照周期处理蒙古黄芪,。实验结果显示，长光照周期处理的毛蕊异黄酮及其糖苷的含量明显高于短光照周期处理的，并随着栽培时间的延长而含量增加。.3. 鉴定了蒙古黄芪的miRNA，并对其异黄酮类代谢关键基因进行靶基因预测：采用二代高通量测序技术检测了蒙古黄芪不同组织的miRNAs，获取了222条独立的miRNA序列，预测与异黄酮代谢途径中关键基因相互作用的miRNA，通过荧光定量PCR和5’RACE实验验证了蒙古黄芪中的miR159c-5p与异黄酮代谢途径中的“开关基因”PAL呈负调控关系，说明PAL基因可能是miR159c-5p的靶基因。.4. 蒙古黄芪不同组织转录组研究：我们对蒙古黄芪的不同组织进行了转录组测序，获得了18.6万多个转录本数据，其中12.9万多个基因被注释；分析蒙古黄芪有效生物活性成分的代谢途径，发现大部分参与异黄酮合成的基因在叶片中表达量较低，在茎中表达量最高，不同基因的不同拷贝表达模式不同。.5. 已发表和接收论文4篇，其中2篇论文被SCI收录。