基于二氧化锰微电极阵列单细胞分选系统的构建及在循环肿瘤细胞异质性检测的应用

Tumors can exhibit significant heterogeneity, which is responsible for the struggle of the patient with cancer. When it comes to therapy decision making, heterogeneity should be taken into account. Circulating tumor cells (CTCs) are attractive biomarkers for therapy response and heterogeneity analysis. However, efficiency and purity of CTCs isolation can not fulfill the requirement of heterogeneity analysis. This proposal is plan to setup a novel platform for isolating a single CTC form human blood and analyze its heterogeneity based on manganese dioxide micro-electrode array. The work will focus on 1) capture of CTCs by using Manganese dioxide micro-electrode modified with anti-Ep CAM and anti-CD146, 2)the single cell isolation for the targeted CTC based on electrochemical etching from micro-electrode array. 3) heterogeneity analysis of the CTCs based on the single cell isolation platform for PD-L1 therapy. It is expected this study may pave a way to isolate a single CTC from human blood for its single cell analysis. Moreover, a novel heterogeneity analysis technology can be designed to analysis the causes and consequences of CTCs heterogeneity and the therapeutic perspective.

循环肿瘤细胞（CTCs）的单细胞分析是评价肿瘤异质性的重要手段，但目前CTCs的单细胞分析常会受到分选技术漏选和错选的影响，造成肿瘤异质性分析准确性的下降，导致癌症靶向药物治疗方案制定和疗效评估关键依据的缺失。本项目拟基于二氧化锰微电极阵列开发一种新型单细胞分选系统，高效率、高选择性分选人血中单个循环肿瘤细胞。首先通过调控电极尺寸实现单个微电极对单个CTC的捕获；并针对CTCs潜在的上皮间质转化特性，利用双重特异性细胞吸附分子修饰二氧化锰微电极，减少漏选，提高其捕获能力；再使用电化学方法腐蚀指定微电极，对目标细胞定点释放，降低CTCs团簇和细胞非特异性吸附对单细胞分选的干扰，实现CTCs的精准分选；进而应用上述分选系统，选择PD-L1免疫治疗的癌症病人，检测其血液中CTCs上特异抗体的荧光表达差异，科学评估肿瘤异质性对PD-L1靶向药物治疗效果的影响，指导癌症靶向药物治疗方案的制定。

本项目成功基于二氧化锰纳米结构构建针对循环肿瘤细胞的捕获、释放系统，研究了电化学环境中，电场对细胞捕获与释放的影响，并成功制备了二氧化锰微电极阵列系统，实现了单个微电极对单个细胞的捕获及释放。首先通过二氧化锰的自组装技术，在导电玻璃与金衬底上制备了约180nm厚的二氧化锰薄膜，通过对二氧化锰表面的细胞吸附分子修饰，实现了二氧化锰薄膜对细胞的捕获。以导电衬底上的二氧化锰纳米薄膜为工作电极、导电玻璃为对电极、PBS磷酸缓冲溶液为电解质构建了电化学系统，通过电化学刻蚀，切断了捕获细胞与沉底之间的联接，实现了对捕获细胞的释放。进一步研究发现，电化学作用下，两电极之间的电场能显著加快二氧化锰纳米薄膜对细胞的捕获速率。在此基础上，通过光刻技术，构建了二氧化锰微电极阵列，实现了单个电极对单个细胞的捕获。另外，对单个微电极施加0.8V电压，可实现对目标电极的电化学刻蚀，实现单个电极上单细胞的释放。最后，初步探索了针对二氧化锰微电极阵列上捕获细胞的电穿刺技术，加快了胞外分子进入胞内的速率。本研究为循环肿瘤细胞的单细胞筛选提供了坚实的工作基础，为抗癌药物分析提供了启示性线索。项目发表核心论文5篇，待发表论文2篇。培养研究生3名，其中1人在读。项目投入经费25万元，支出24.2万元，剩余经费计划用于本项目研究后续支出。