基于多位点免疫脂质磁球技术的肿瘤单细胞分选鉴定系统的构建及在儿童脑胶质瘤诊断方面的应用

The lipid immune magnetic ball was adopted in this project for immunofluorescence glioma circulating tumor cell separation identification system, and were used for single-cell sequencing in patients with brain glioma in children in real-time monitoring of tumor cells through the change of the number of tumor cells in blood and cerebrospinal fluid. Comprehensive analyses of cancer genomes promise to inform prognoses and precise cancer treatments. We also want to analysis an integrated process to isolate, qualify and sequence whole exomes of CTC with high fidelity, using a census-based sequencing strategy. Combined with the clinical data of patients, pathology and imaging data, children's blood and cerebrospinal fluid in patients with cerebral glioma tumor cell number, the sequencing results and clinical information (tumor classification stage, chemotherapy sensitivity, resistance, radiation sensitivity, prognosis prediction) will be explored. The relationship between CTC data and clinical feature will be used to guide the clinical doctor's judgment and individualized treatment.

本项目将基于已有的多功能免疫脂质磁球（EpCAM、GFAP、SYN、VIM等大分子免疫磁球，具有类细胞双层膜结构的高细胞亲和分选能力）及免疫荧光技术，对不同的儿童脑瘤类型（髓母神经瘤、室管膜肿瘤、PNET等）的患者脑脊液及血液中的肿瘤细胞进行分离鉴定；在对获得的肿瘤单细胞进行计数的基础上，结合肿瘤单细胞的免疫组化/Fish信息，及肿瘤单细胞的基因突变和全基因组测试数据，结合临床特征（病理、肿瘤分级分期、化疗敏感性、耐药性、放疗敏感性、预后预测等），探寻肿瘤细胞的异质性特征，并最终对患者进行个体化的诊断评估分析，指导临床治疗。项目的进行将开拓一种全新的适合不同肿瘤的液体活检单细胞分析技术，具有重大的临床实用价值。

本项目基于表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）和胶质原纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP）抗体免疫脂质磁球技术与免疫荧光鉴定技术，构建免疫磁球/免疫荧光为核心的儿童脑肿瘤循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）分离鉴定系统，用于对儿童脑肿瘤患者外周血和脑脊液中的CTC进行高效的捕获与鉴定。通过细胞实验、动物实验、临床验证和基因检测等方法，评估该系统的稳定性、安全性和有效性，并验证通过该分离鉴定系统获得的细胞为循环肿瘤细胞。.初步临床验证表明，G-ML可有效地捕获脑肿瘤患儿外周血和脑脊液中的CTC，染色效果清晰可辨。无论是在脑肿瘤患儿的脑脊液中还是在其血液中，CTC数量与肿瘤的WHO分级、患儿年龄均无显著相关性。对入组的脑肿瘤患儿进行影像学检查和肿瘤实体标本的病理学检查，其影像学诊断和免疫组化结果一致。对患儿进行随访，死亡的患儿有15例（23.08%），1年生存率为82%。结果显示，年龄、性别和WHO分级与生存时间没有显著性差异。而脑脊液中CTC数量与生存时间有显著相关性，CTC数量越多，生存时间越短，预后越差。部分髓母细胞瘤患儿（Group 3）的血液和脑脊液CTC中的NPR3基因表达水平高表达，其对应的肿瘤标本组织肿瘤细胞的NPR3免疫组化呈阳性，两者结果一致。部分弥漫性内源性桥脑胶质瘤患儿进行Sanger测序，在脑脊液和组织中检测到H3K27M突变，在血液中检测到BRAF突变，提示基因检测在脑脊液标本中可能更有效。 .总之，本研究形成了一套高效精准的儿童脑肿瘤CTC检测体系。该体系具有无创、便捷、动态监测的优点。与基因检测相结合，对儿童脑肿瘤的早期筛查与诊断、疗效检测和预后评估都具有重要的临床参考价值。