用于循环肿瘤细胞高效分选和单细胞精度分析的成像流式检测仪研究

Circulating tumor cells (CTC)，as new tumor test samples in recent years, plays an important role in research of mechanism of tumor metastasis, early diagnosis of cancer, prognosis assessment and individualized treatment. However, there are various limits in the detection technology for CTCs due to their few amount and heterogeneity of the cells. This project aims at technology for CTC detecting instrument of efficient separation as well as suitable of the key problems, will develop imaging flow detector combining multi-stage separation on a chip, module of imaging flow detection as well as combining of technology and methods to study the effective separation of circulating tumor cells and single cell precision analysis. We hope to realize 1) complex operation of continuous injection of blood sample, the multi-stage separation, single cell manipulation, single cell transshipment and single CTC analysis in the same chip.2) CTC efficient separation in the complex blood samples, and to achieve single CTC high sensitivity, multi-parameter detection (determination the number of biological molecules above 6 at the same time), in situ fast analysis and detection; 3) to explore the number of CTC of liver cancer patients, molecular characteristics and the change of heterogeneity in the process of patients’ treatment. If it is successful, the proposed project will provide an important platform, also help to greatly promote the development of CTCs detection and relative research.

循环肿瘤细胞(CTC)作为近年来新出现的肿瘤检测样本，在癌症的早期诊断、预后评估、个体化治疗和癌转移机制研究等方面具有重要意义。但因CTC数量极少且具异质性，CTC检测在技术手段上还面临巨大挑战。本项目拟针对“高效分选和适配的检测仪器”等关键问题，通过对多级分选芯片、成像流式检测模块以及它们结合技术的研究，研制用于循环肿瘤细胞高效分选和单细胞精度分析的成像流式检测仪，实现：1)同一块芯片上连续的血液样品注入、多级分选、单细胞操纵与转运、单个CTC分析等多步复杂操作；2)复杂血液样品中极少量CTC高效分选的同时实现单个CTC的高灵敏、多参数（同时检测生物分子或蛋白的数量为6种及以上）、原位快速的分析检测；3)探究肝癌病人CTC的数目、分子特征以及治疗过程中异质性的变化。项目的实施将为CTC检测提供一种重要的技术平台，有助于促进CTC检测及相关研究的深入与发展。

本项目围绕循环肿瘤细胞（CTC）检测的关键问题和预定目标，开展并完成了较为系统的新技术、新仪器与新方法研究。针对CTC含量稀少、背景复杂以及高效的分离与分选问题，设计并制作了二种能够支撑CTC的分离、3D聚焦、单细胞分析、分型计数与分选等操作的多级微流控芯片，并通过数值模拟和实验确认了芯片结构和操作参数。针对CTC异质性强、分型多样以及高通量的单细胞分析问题，设计并建立了一种具有“双色激光同时激发、四色荧光同步探测、同时用这四个荧光参量对单个细胞进行实时在线分析、分型计数与结果输出”等功能的多色荧光检测技术；开发了一种新颖的快速灵活分辨和分型计数CTC的数据处理与在线分析软件；完成了多色荧光检测及其相应软件的性能测试，荧光微球或细胞的检测频率可达3260个/秒，信噪比大于20，变异系数优于3.4%。基于以上技术，结合系统控制模块的设计与优化，自主研制出集成有多级微流控芯片、多色荧光检测、数据处理和系统控制等模块的光流控流式细胞仪样机；通过对添加到健康人血液中癌细胞的检测，验证了样机可以在一次实验中自动完成血样注入、CTC的分离、3D聚焦、单细胞分析、分型计数等操作与灵敏、高通量检测的有效性和可操作性，达到了预期目标。在此基础上上，利用样机实现了乳腺癌和非小细胞肺癌患者血样中CTC的分离分析和分型计数检测，进一步验证了样机及其所建方法的可操作性和普适性。项目取得的结果与突破，克服了现有CTC分离和分析技术独立、过程繁琐，以及仅仅依靠单一生物标记物抗体捕获或物理特性分离都会低估CTC数量、并导致重要亚群丢失的不足，将为CTC检测、肿瘤液体活检等领域提供一种重要的科学仪器与方法。.项目执行期间，发表标注本基金的SCI论文8篇(影响因子均大于5.0)，申请和授权国家发明专利5件，培养硕士生4人。此外，参加国内学术会议并做报告3次。综上所述，项目的研究目标和任务已经圆满完成。