植物糖基转移酶高表达工程菌减轻抗癌药伊立替康毒性研究

Irinotecan (CPT-11)is one of the most effective and frequently used drugs in chemotherapy of colon cancer. CPT-11 is transformed into the active metabolite SN-38 in vivo. The formed SN-38 undergoes further processes and accumulates in the GI tract, causing serious toxic effects such as delayed diarrhea and decreasing the success rate of chemotherapy. Therefore, it is of clinical significance to find out a safe and efficacious method for detoxifing irinotecan. In our preliminary study, we discovered that plant UGT (pUGT) can catalyze the glycosylation of SN-38. Also，pUGT expressed bacteria (abbreviated as "pUGT bacteria") rapidly metabolize and eliminate SN-38 through the glycosylation reaction. On the basis of previous work, this project will screen and optimize pUGT isoenzymes capable of catalyzing SN-38 metabolism, elucidate the molecular basis for SN-38 glycosylation, determine and evaluate the toxicity alleviation using mice as the model, and explore the mechanisms for toxicity alleviation by the pUGT bacteria. Successful completion of this project will provide a solid scientific foundation for research and development of safe and efficacious detoxifying bacteria for irinotecan.

结肠癌化疗药伊立替康在体内转化为SN-38，SN-38在肠腔内诱发严重的毒副反应（延迟性腹泻），大大降低癌症治疗的成功率。因此，寻找该药安全有效的解毒方法将具有重要的临床意义。我们在前期工作中对SN-38糖基化代谢进行了初步的研究，首次发现植物糖基转移酶（pUGT）具有催化SN-38糖基化反应的活性；并且pUGT高表达细菌（简称pUGT工程菌）能够代谢清除SN-38。本项目拟在前期工作基础上，进一步筛选和优化高活性pUGT酶，明确SN-38糖基化代谢的分子机制，评价pUGT工程菌的减毒效果，并探讨其减毒的作用机制，为研究和开发安全有效的伊立替康解毒工程菌提供科学依据。

本项目在前期工作基础上，对pUGT工程菌优化及CPT-11/SN-38减毒效果与机制进行了系统研究，并取得了以下研究进展：（1）鉴定了代谢SN-38的活性UGT酶（UGT1A1），进而采用“底物比对”和“序列比对”法，筛选到五种具有高代谢活性的pUGT酶：pUGT73C8、pUGT71G1、pUGT78G1、pUGT85H2及pUGT88E1，其中，pUGT71G1和pUGT73C8代谢SN-38的活性最高。（2）采用分子对接和同源模拟技术，建立了糖基酶-底物（SN-38）相互作用的分子模型。SN-38分子包埋在一个由多个残基（包含Phe98、Trp203及 Phe395）组成的疏水性口袋中，且与多个残基（如His20、His153及Met157）形成氢键作用，这些氢键对SN-38的代谢活性起关键作用。此外，筛选到两个主要经由UGT代谢清除的化合物（Chrysin和Gossypol），用于减毒机制研究与探讨。（3）采用pET28a表达载体，成功制备、获得了pUGT71G1及pUGT73C8工程菌。代谢活性评价表明，两种工程菌可通过糖基化代谢和胞内蓄积，较快地代谢清除SN-38。然而，高表达pUGT71G1的罗伊氏乳杆菌代谢SN-38的能力最强。此外，构建了细胞动力学模型，阐明了SN-38的细胞代谢处置过程，发现SN-38本身可通过被动扩散机理穿透胞膜，并且外排转运体（BCRP和MRP）及水解酶参与SN-38代谢物的外排过程，具有影响原型体内处置的潜在性。（4）基于小鼠模型，考察了工程菌的对CPT-11/SN-38毒性的解毒潜力。发现工程菌可显著降低CPT-11/SN-38的肠毒性，其根本原因可能是工程菌通过肠腔内摄取与糖基化代谢，极大地改变了UGT底物（SN-38或Chrysin）的体内代谢动力学（降低了药物的系统及肠组织局部的暴露水平），增强了毒性成分SN-38的粪便排泄。通过本项目的研究，已在Biochemical Pharmacology、Drug Metabolism and Disposition、Xenobiotica国际期刊发表SCI收录论文3篇，申请发明专利1项，依托本项目已培养博士生1人、硕士生2人、博士后1人。