基于体内过程与双向调控Mrp-2探讨生姜泻心汤减轻伊立替康肠毒性的“体内显效形式”

Multidrug resistance-associated protein-2 (Mrp-2) is a transporter mediating the biliary excretion of the exogenous substances and the efflux of potential toxic substances from gut epithelial cells. Shengjiang Xiexin Decoction (SXD) is used to alleviate irinotecan-induced gastrointestinal toxicity in modern clinical practice. In our previous study, SXD was found to decrease the toxic metabolite (SN-38) level in the intestine by reducing the biliary excretion of SN-38. The underlying mechanism of SXD involves down-regulating hepatic Mrp-2 expression. However, the expression of jejunal Mrp-2 was found to be up-regulated by SXD. 9 flavonoid aglycones of SXD exposed to intestinal lumen were observed to enhance the efflux function of Mrp-2 by the combination of the network pharmacology and the vesicular transport assay. In order to illustrate the dual regulation of SXD on hepatic and intestinal Mrp-2 expression/function, the technologies of serum pharmacochemistry, pharmacology and pharmacokinetics and the computer-aided screening method will be integrated to explore the PK-markers of SXD in hepatic and intestinal tissue in the present study. Molecular docking analysis will be used to dock the PK-markers with the target Mrp-2. The dual regulation of PK-markers on Mrp-2 will be evaluated by in vitro cell models to illustrate the active constituents in vivo for alleviating the gastrointestinal toxicity.

Mrp-2转运体既是介导外来物胆汁排泄的转运蛋白，又是阻止外来物侵入正常肠细胞的外排蛋白。生姜泻心汤（SXD）为临床上用于防治伊立替康肠毒性的有效方剂。前期研究发现，SXD能够下调肝脏Mrp-2表达，抑制Mrp-2介导的毒性代谢物SN-38胆汁排泄，进而降低肠道内SN-38积蓄。与此相反，SXD上调肠道Mrp-2的表达。结合网络药理学和体外药效验证，发现方剂中暴露于肠道内的9个黄酮苷元可增强Mrp-2外排功能，可能是SXD保护正常肠细胞的重要因素。为了阐释SXD对肝肠Mrp-2产生的不同调控作用，本项目拟在已有基础上，整合血清药物化学、药理学，药代动力学和虚拟辅助筛选方法，寻找SXD到达肝、肠靶器官的药代标志物，并基于分子对接技术对这些标志物开展Mrp-2作用筛选，以细胞模型评价对接结果突出的成分对Mrp-2的抑制或激活作用，从双向调控Mrp-2的角度探寻具有“减毒”作用的体内效应物质群。

Mrp-2转运体既是介导外来物胆汁排泄的转运蛋白，又是阻止外来物侵入正常肠细胞的外排蛋白。生姜泻心汤（SXD）是临床上用于防治伊立替康所致迟发性腹泻的有效方剂。前期研究发现SXD对介导伊立替康及其代谢物外排的Mrp-2转运体具有双向调控作用，以减少代谢物SN-38在肠道内蓄积，进而保护正常肠上皮细胞。诠释SXD通过调控Mrp-2蛋白以缓解伊立替康肠毒性的显效成分是SXD传承和现代化开发的关键科学问题。本项目采用体内过程与目标靶点Mrp-2相结合的研究思路，以液相色谱-质谱联用技术为主要分析手段，分析SXD缓解伊立替康肠毒性的药效物质。主要研究内容和结果如下：建立SXD提取物化学指纹图谱，共鉴定分析270个化合物，在化学物质精细表征的基础上，实现生姜泻心汤体内代谢物质组的全面分析，SXD大部分黄酮化合物和少数苯基烷类、三萜及生物碱是体内主要药源性成分，以不同的存在形式分布于血浆、胆汁和肝肠组织中，代谢反应主要以葡萄糖醛酸和硫酸结合为主；结合LC-MS定量/半定量研究方式，系统全面地描述SXD体内成分血药浓度动态变化轮廓和胆汁排泄情况，利用多元统计方法筛选出76个PK-markers，主要为黄芩苷、汉黄芩苷、（异）甘草苷和甘草酸等成分的相关代谢产物；进一步地，基于分子对接技术，从中发现55个PK-markers与MRP-2转运体具有较高的结合力，将其视为SXD体内显效成分；在细胞水平上验证了甘草苷、异甘草苷、甘草酸、千层纸素A 7-O-gluA和甘草次酸能够抑制Mrp-2表达，而汉黄芩素、千层纸素A和在血浆中浓度极低的黄芩素、甘草素、异甘草素及白杨素则增强Mrp-2的表达。黄芩苷和汉黄芩苷作为底物被Mrp-2蛋白转运，竞争性地抑制了Mrp-2对其他底物的转运；同时，本项目扩展了肠道菌群对黄酮苷元代谢转化的研究，发现除常见的去甲基化等代谢反应类型外，还存在氨基酸结合、氨基化和巯基化等代谢反应。本项目研究结果不仅为其临床使用提供理论依据，同时为其质量控制研究奠定基础。