RED重组酶与内源Ku蛋白在莱茵衣藻核基因同源重组定向改造中的相互作用分析

In the developmental application of microalgae resources, the targeted genome modification technique has become an important approach in breeding new lines of microalgae with high economic value. This technique, however, has not been well established. Limitations in precise DNA insertion, knockout or replacement in nuclear genome are still the main of bottlenecks in microalgae genetic engineering. In order to solve this problem, using Chlamydomonas reinhardtii as the representative of algae，we will Knockout of the Ku protein and import “on demand” expressed Red recombinase to improve the efficiency of the homologous recombination and to establish targeted genome modification in Chlamydomonas reinhardtii. Moreover, we shall further analysis of the roles and correlations of key proteins in the nuclear genome editing, reveal cell intrinsic changes resulted from Chlamydomonas homologous recombination editing technology, and discover the molecular mechanism of the effect of endogenous Ku protein and exogenous recombinant protein on other key genes of homologous recombination. This research reflects the original innovation of microalgal application and basic science research, and provides important theoretical basis and technical support for the breeding of microalgae and the development of microalgae industry.

随着微藻资源的开发应用，基因组定向改造技术已经成为选育高经济价值藻类新品系的重要途径。但到目前为止，真核微藻的基因组定向改造体系尚不成熟，如何实现核基因组特定区域DNA的插入、敲除和替换已经成为微藻基因工程改造的瓶颈。本项目以莱茵衣藻为对象，拟通过敲除Ku蛋白降低NHEJ和导入可“按需”表达Red重组酶提高HR效率的策略，建立莱茵衣藻基因组同源重组定向改造系统，并进一步分析关键蛋白在核基因编辑中的角色及相互关系，认识衣藻同源重组编辑技术的细胞内在过程变化，发现内源Ku蛋白和外源重组蛋白对同源重组其他关键基因影响的分子机理。该研究体现了微藻应用与基础科学研究的原始创新性，为微藻优良性状性品系选育及微藻产业发展提供重要的理论基础与技术保障。

随着微藻资源的开发应用，基因组定向改造技术已经成为选育高经济价值藻类新品系的重要途径。但到目前为止，真核微藻的基因组定向改造体系尚不成熟，如何实现核基因组特定区域DNA的插入、敲除和替换已经成为微藻基因工程改造的瓶颈。为了解决上述瓶颈，本项目以莱茵衣藻作为研究对象，通过敲除Ku蛋白降低NHEJ和导入可“按需”表达重组酶提高HR效率的策略，建立莱茵衣藻基因组同源重组定向改造系统。项目执行期间，本项目证实了莱茵衣藻crKu蛋白在基因组DNA双链断裂的NHEJ修复中的起关键作用；项目在莱茵衣藻中建立了crDD不稳定域严谨调控体系，探明了体系中配体最佳浓度、响应时间、诱导时间、细胞周期、基因表达量等关键特征，建立了一套快速、可逆、浓度依赖的按需调控技术；项目还进一步利用不稳定域技术调控了编辑蛋白cas12a的表达，首次在莱茵衣藻中实现了cas编辑蛋白在基因组中的稳定、整合型“按需”可控表达。随后，我们在含编辑蛋白的工程藻株中又导入含gRNA的质粒，通过筛选获得了成功编辑了莱茵衣藻PSY或SNRK2基因的工程藻，完成了莱茵衣藻基因组的编辑。项目建立了一套全新的利用质粒DNA进行DNA编辑的标准化基因组编辑改造技术；我们还构建了过表达外源同源重组酶的工程藻，通过组学分析证明了同源外源的同源重组酶在DNA修复过程中的作用；本项目申请了国家发明专利7项，其中授权发明专利2项。项目共发表论文11篇，其中中文核心期刊3篇，SCI论文11篇；本项目培养微藻基础与应用方面的研究生3人、博士后2名、本科生4名。综上所述，本项目已经全面完成项目研究目标。该研究体现了微藻应用与基础科学研究的原始创新性，为微藻优良性状性品系选育及微藻产业发展提供重要的理论基础与技术保障。