细菌脂肪酶高效表达与高通量筛选相匹配的通用系统研究

细菌脂肪酶因种类多、性能优良，在油脂加工、材料、能源、医药等新兴领域内发挥重要作用，成为最具生产价值和开发潜能的催化剂。但原始菌株产酶不稳定、产量低，且目前的商业化表达系统也无法解决这一困难，严重阻碍了细菌脂肪酶的商业化应用进程。针对上述问题，本课题拟将T7高效表达系统和促脂肪酶分泌蛋白一起导入恶臭假单胞菌，并同时删除菌株内在的脂肪酶和蛋白酶，构建出背景透明、无降解威胁、胞外分泌效率高的宿主菌。在此基础上，本课题首次提出将细菌脂肪酶高效表达与高通量筛选相互结合的构建策略，一方面通过设计双表达单元的表达载体实现脂肪酶高效表达，另一方面借助表面展示和荧光分选等技术完成脂肪酶高通量筛选系统，实现两者之间的完美匹配。该研究可解决细菌脂肪酶的表达困境，加速细菌脂肪酶工业化进程，同时也为脂肪酶体外分子改造提供了良好筛选和表达平台，具有良好的应用前景和工业化价值。

细菌脂肪酶种类多、数量大且性质优良对胁迫环境耐受性强，但由于缺乏成熟的表达系统导致大部分细菌脂肪酶在大肠杆菌中表达为无活性的包涵体，在毕赤酵母中表达量低下。本研究主要针对如何提高细菌脂肪酶表达量这一关键问题进行了深入研究，构建出了适于表达细菌性脂肪酶的表达系统，并利用该系统进行了高通量筛选研究，取得了具有创新性的研究结果：（1）构建了表达宿主菌，其中恶臭假单胞菌KT2440中两个内源胞外脂肪酶基因lip1 和lip2被敲除，洋葱假单胞P. cepacia GJ中一个内源脂肪酶基因lip1被敲除。所有敲除脂肪酶基因的工程菌株经脂肪酶检测平板和揺瓶发酵均无脂肪酶表达，且菌株的生长基本没有收到抑制。此外，本研究还对P. putida KT2440中两个内在胞外碱性蛋白酶基因进行敲除，结果发现蛋白酶基因pro2 对细菌生长是必须的，蛋白酶基因pro1基因敲除后细胞生长受显著影响。（2）建立了以尿嘧啶磷酸核糖转移酶为反向筛选标记的假单胞菌基因组定点重组方法，在假单胞菌中定点删除了内源性脂肪酶基因，获得了基因重组菌。（3）在假单胞菌中建立了T7 高效表达系统，将来源于λ噬菌体的T7 RNA聚合酶基因导入假单胞菌中。本研究通过转座子的方法增加T7 RNA polymerase 拷贝数，提高T7 RNA聚合酶基因的效率。同时构建含有T7 启动子的表达质粒pBRT7，用于外源脂肪酶基因的表达。（4）利用T7 表达系统实现了脂肪酶基因的高效表达。洋葱假单胞菌脂肪酶基因lippc克隆入T7启动子表达载体pBRT7中，电转化入含T7 RNA聚合酶基因的宿主菌，获得了能表达洋葱假单胞菌脂肪酶的基因工程菌。工程菌经优化后脂肪酶表达量明显增加。脂肪酶表达工程菌的最优发酵培养基为：尿素含氮量0.15%，豆饼水解液4%，糊精0.5％，麦芽糖0.5%，橄榄油乳化液2%，MgSO4•7H2O 0.05%，K2HPO4 0.2%。该条件下洋葱假单胞菌的发酵活力为70.88U/mL，与野生型相比提高了6.8倍。（5）筛选出一批产优良性状的脂肪酶菌株，部分菌株鉴定为新物种，其中N16-3A1菌株所产脂肪酶在4度仍有活性，菌株的产酶活力达238.35U/mL。另外两株产酶假单胞菌LYBRD3-7和WZBFD3-5A2均为首次分离并已鉴定为新物种。