同源重组酶Rad51与DNA动态相互作用分析方法研究

In eukaryotes, Rad51 protein repairs DNA double-strand breaks by homologous recombination, which is essential for maintaining genome integrity and stability. The crucial step is that Rad51 assembles onto single strand DNA (ssDNA) to form nucleoprotein filament, which then promotes strand exchange with homologous chromosome. However, it remains unknown the structure of Rad51-ssDNA nucleoprotein filament for Rad51 dynamically assembling onto ssDNA and promoting strand exchange under physiologically relevant ATP hydrolysis. Here, we propose a project to develop a capillary electrophoresis-laser induced fluorescence polarization (CE-LIFP) analysis and to study of the dynamics of human Rad51-ssDNA nucleoprotein filament. It could accurately determine the binding stochiometry of human Rad51 monomer in the dynamic nucleoprotein filament and identify the type of Rad51-ssDNA nucleoprotein filament for promoting strand exchange with homologous double strand DNA (dsDNA). We further study the effect of recombination accessory proteins on formation of dynamic nucleoprotein filament and strand exchange. This study will clarify the molecular mechanism of the dynamic assembly of active Rad51-ssDNA nucleoprotein filament and mediating strand exchange. It is expected that the study will further help us to understand homologous recombination repair and the incidence and development of cancer.

在真核生物中，Rad51通过同源重组修复DNA双链断裂，以维持基因组完整性与稳定性。Rad51在单链DNA（ssDNA）上组装形成核蛋白纤维丝介导同源染色体链交换是同源重组过程的核心步骤。然而，在生理条件ATP水解下，Rad51在ssDNA上动态组装形成核蛋白纤维丝的结构及其介导链交换的分子作用机制还未知。我们提出发展毛细管电泳-激光诱导荧光偏振分析技术，研究Rad51与ssDNA相互作用形成动态的核蛋白纤维丝，准确测定Rad51在核蛋白纤维丝中的结合计量学，鉴定具有介导同源双链DNA（dsDNA）链交换活性的Rad51-ssDNA核蛋白纤维丝类型。在此基础上，进一步研究一些辅助蛋白对动态的Rad51-ssDNA核蛋白纤维丝和其介导链交换的调控作用。通过本研究将揭示Rad51在ssDNA上动态组装形成活性核蛋白纤维丝介导链交换反应的作用机制，有助于人们对同源重组修复与癌症发生发展的认识。

同源重组是DNA双链断裂修复中的一条重要通路，其中重组酶在单链DNA（ssDNA）上组装形成核蛋白纤维丝介导同源染色体链交换是同源重组过程中的核心步骤。本团队在先前的研究中发现生理条件ATP水解下原核生物大肠杆菌重组酶RecA在ssDNA上组装形成非饱和的核蛋白纤维丝介导同源双链DNA（dsDNA）发生链交换，然而真核生物重组酶Rad51在ssDNA上动态组装形成能够介导链交换的活性核蛋白纤维丝的结构还未知。我们利用分子克隆技术成功构建了人源重组酶hRad51原核表达系统的重组质粒pET28a-hRad51，通过多步层析技术纯化获得纯度高达90%的hRad51，采用本团队的毛细管电泳-激光诱导荧光偏振特色装置发现当溶液中的Ca2+达到10 mM时hRad51在ssDNA组装可以形成带正电荷的核蛋白纤维丝，这种带正电荷的hRad51-ssDNA复合物可能是寻找并介导同源dsDNA发生链交换的活性核蛋白纤维丝，为深入理解同源重组修复机制提供理论依据。其次，复旦大学于文强教授团队发现新冠病毒基因组（RNA）与人类基因组存在5段序列完全相同的片段（HIS），并且存在启动子区域。我们有幸与于文强教授合作，采用紫外吸收光谱发现新冠病毒RNA可与ssDNA结合形成更稳定的DNA-RNA杂合体，并通过凝胶阻滞电泳观察到DNA-RNA杂合体与hAGO2蛋白质具有更高的亲和力，为揭示新冠病毒的致病机制和防治提供提供了一种新的可能性。