猪克隆胚胎早期有丝分裂进程中Plk1的调控作用与机制研究

Polo-like kinase 1 (Plk1) play an important role in regulation of G2/M phase transformation, and starting mitotic events in somatic mitosis process, however, its roles in porcine cloned embryonic mitosis is still unclear. IVF embryos will be used as the control, western blotting and immunofluorescent techniques will be performed to analyze the expression and subcellular localization of Plk1 in porcine cloned embryos early mitotic progression. Temporal and spatial relationship between Plk1 and cytoskeletal proteins will also be determined by confocal microscopy. To investigate the significance function of Plk1 in porcine cloned embryonic mitosis process, the expression of Plk1 will be knocked down by microinjection of Plk1 shRNA plasmid or the kinase activity of Plk1 will be inhibition by Volasertib．We will detect the expression of Plk1 and its kinase activity changes after inhibition of MEK-ERK signaling．The aim of this study is to determine the effects of Plk1 on the mitosis of porcine SCNT embryos, so as to establish a basis for the further research on the development mechanism of porcine cloned embryos.

在体细胞有丝分裂进程中，Polo-like激酶１(Plk1)对G2/M期转化，启动有丝分裂等具有重要的调控作用，但该激酶是否也参与猪克隆（SCNT）胚胎早期有丝分裂的调控目前仍不明确。本研究拟以猪体受精(IVF)胚胎为参照，采用免疫印迹结合免疫荧光等方法检测Plk1在猪SCNT胚胎早期有丝分裂进程中的动态表达与亚细胞定位；同时利用激光共聚焦成像技术观察Plk1动态表达与微管、微丝等细胞骨架蛋白分布的时空相关性；在此基础上，通过RNAi与Volasertib抑制激酶活性等方法研究Plk1表达与激酶活力对猪SCNT胚胎有丝分裂进程的影响；最后通过AZD6244特异性抑制试验进一步分析Plk1是否通过MEK-ERK信号通路参与调控猪SCNT胚胎早期有丝分裂进程。本研究旨在揭示Plk1在猪SCNT胚胎早期有丝分裂进程中的功能及其可能的分子机制，为深入研究克隆胚胎早期发育机制提供实验参考。

Polo-like激酶1(Polo-like kinase 1, Plk1)是一种广泛存在于真核细胞中，结构高度保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，是近年来体细胞、尤其是肿瘤细胞有丝分裂周期调控的研究热点，但关于Plk1在动物胚胎、尤其动物克隆（SCNT）胚胎发育调控中的功能尚不明确。本项目首先按原计划采用Western blot与间接免疫荧光技术系统研究了Plk1在核移植前后的核供体细胞、核受体卵母细胞及SCNT胚胎各细胞分裂期的动态表达与亚细胞定位，结果发现Plk1无论是在核受体卵母细胞、核供体细胞，还是在重构SCNT胚胎中均有表达，并具有明显的细胞周期阶段性特点，在细胞分裂的前中期主要聚集在染色体周围，而在细胞分裂中后期，则主要聚集在中期赤道板两侧，与纺锤体α-tubulin蛋白具有明显的共定位关系。进一步采用特异性抑制剂GSK461364对细胞内源性Plk1进行抑制后，结果发现核受体卵母细胞细胞减数分裂失败，并阻滞在GVBD期，SCNT胚胎卵裂失败，并停滞在首次有丝分裂前中期，均伴随有纺锤体异常组装与染色体错误排列等现象。这些结果表明，Plk1无论是对核受体卵母细胞成熟分裂，还是对猪早期胚胎首次有丝分裂进行，均发挥着不可或缺的作用，Plk1对于细胞分裂前中期纺锤体组装以及染色体排列等重要生物学事件具有重要的调节作用。为进一步探究Plk1调控的分子机制，项目进一步通过Western blot等技术对Plk1的调控上（Aurora A）、下游信号分子（Mad2和BubR1）进行了研究鉴定。结果发现将Aurora A激酶活性抑制后，不仅导致p-Plk1（Thr-210）表达水平显著下降，同样也伴随着细胞周期阻滞、纺锤体异常组装与染色体错误排列等现象；进一步研究发现Plk1激酶活性抑制后，对BubR1蛋白表达无明显影响，但显著降低了Mad2蛋白的表达水平。以上结果表明，Plk1主要通过Aurora A-Plk1- Mad2信号通路来参与猪受体卵母细胞减数分裂与SCNT胚胎早期有丝分裂进程的调控。本项目已完成所有研究内容，并取得积极成果，完成了所有的预定目标。本项目研究结果对于进一步认识动物克隆胚胎发育机理、实施生殖调控，具有重要的意义，同时为进一步提高猪等家畜胚胎的体外生产效率提供了理论与试验依据。