有丝分裂期的组蛋白磷酸化及其调控染色体行为的研究

Mitosis is the basis for the growth and development of eukaryotes. Genomic instability and aneuploidy resulting from improper chromosome segregation during mitotic cell division are thought to contribute to tumorigenesis. Studies of chromosome segregation are therefore required to discover ways to prevent and treat these diseases. Protein kinases have been a focus of work in this area because they are key regulators and proven therapeutic targets. Our ground-breaking discovery that histone H3 phosphorylation at threonine 3 (H3T3ph) ensures accurate chromosome segregation has deciphered a key piece of "histone code" in mitosis. However, much remain to be explored the role of various histone modifications in mitosis. In this study, we aim to determine whether H3T3ph regulates G2 phase DNA damage recovery, G2/M transition and down-regulation of gene transcription in mitosis. By identifying the kinase responsible for phosphorylation of histone H3 at threonine 11 (H3T11ph) and the effecter protein reading this modification, we will determine the roles of H3T11ph in regulating the functional integrity of chromosomal territories and accurate segregation of sister chromatids in mitosis. We will also study the complex cross-talk between various mitotic histone modifications. Upon successful conclusion of this work, we will have determined the spatiotemporal regulation and roles of histone phosphorylation in mitosis, and provided novel insights into the mechanism for the orchestrated regulation of chromosome segregation.

有丝分裂是真核生物发生与发育的重要基础，探索这一基本生命活动的本质，对于癌症的防治具有重要指导意义。申请人近年来发现蛋白激酶通过磷酸化组蛋白调控染色体的分离，这一突破性进展使得有丝分裂期"组蛋白密码"的解析成为亟待深入的研究热点。本项目将综合应用分子、细胞、化学生物学和生物化学等学科的方法，辅以荧光显微镜、质谱和流式细胞仪等技术，系统深入地研究有丝分裂期组蛋白的磷酸化。重点将探索组蛋白H3第3位苏氨酸的磷酸化（H3T3ph）在促进G2期DNA损伤修复，有丝分裂进入，以及有丝分裂期基因转录抑制等方面的新功能；通过鉴定H3第11位苏氨酸磷酸化（H3T11ph）的激酶和识别该修饰的效应分子，探明H3T11ph在调节染色体的重要功能区及促进染色体分离等方面的作用；同时将整合分析组蛋白修饰互作的分子网络。本项目的顺利实施，将阐明有丝分裂期组蛋白磷酸化的时空调控及重要功能，揭示调控有丝分裂的新机制。

组蛋白修饰参与调控细胞周期、基因转录和DNA 损伤反应。在有丝分裂过程中，组蛋白修饰是调控染色体行为的重要因素。例如，由蛋白激酶Haspin介导的组蛋白H3第3位苏氨酸（H3T3）的磷酸化通过为染色体乘客复合体（Chromosomal Passenger Complex，CPC）提供结合位点，调节CPC在内着丝粒区的定位，促使其激酶组分Aurora B正确行使功能，保障染色体的精确分离。但是在此过程中，蛋白激酶Haspin对H3T3的磷酸化最初如何被激活及其时空调控的分子机制尚不清楚。我们发现，在有丝分裂前期，蛋白激酶Plk1能以一种依赖于Cdk1激酶活性的方式结合于Haspin，并激活其活性。这些研究结果揭示了Haspin介导的组蛋白H3T3磷酸化在有丝分裂初期被激活的机理。.黏连蛋白复合体（cohesin）介导的姐妹染色单体黏连是有丝分裂期间染色体精确分离的前提。在有丝分裂的前期，黏连蛋白抑制蛋白Wapl能结合到cohesin的调节亚基Pds5B上面，大量地去除染色体臂上面的黏连蛋白。着丝粒区域的黏连蛋白如何不被Wapl去除的机理目前不甚清楚。我们发现，在细胞中表达无激酶活性的Haspin突变体或者用Haspin的小分子抑制剂处理细胞，都会导致着丝粒区域粘连缺陷。但是，破坏细胞中H3pT3与Survivin相互作用不会造成姐妹染色体粘连的缺陷，表明Haspin不是通过H3pT3招募CPC复合体到着丝粒区域来实现对着丝粒区域黏连的保护。我们进一步研究发现，蛋白激酶Haspin通过其碳端激酶域来结合并且磷酸化Wapl的YSR基序，因此抑制Wapl通过YSR基序与Pds5B的结合。在细胞中表达不能和Wapl结合的Haspin突变体，细胞有丝分裂期间都会出现着丝粒区域黏连缺陷；而且，在Wapl的YSR基序中导入磷酸化模拟突变，会抑制Wapl与Pds5B的结合以及对黏连蛋白的去除；而将Haspin的激酶域人为定位到着丝粒区域，可以部分取代Haspin通过结合Pds5B来保护染色体黏连的功能。这些结果表明，Haspin在有丝分裂期间可以通过激酶活性来拮抗Wapl，进而保护着丝粒区域的染色体粘连。