基于TRPC6/CREB通路研究黄芪中毛蕊异黄酮抗脑缺血损伤的作用机制

Radix Astragali has the characteristics of invigorating Qi and promoting blood circulation. It is commonly used for treating ischemia stroke. Calycosin is an important active constitutent of Radix Astragali. Our previous studies had demonstrated that calycosin exhibited the neuroprotective effect on cerebral I/R injury. However, its mechanisms are also unclear. Recent studies suggested that inhibiting calcium overload-mediated calpain activation, preventing TRPC6 proteolysis and strengthening the expression of CREB phosphorylation were an important survival pathway after cerebral ischemia injury. Our preliminary experiments showed that calycosin can significantly inhibit calpain activation induced by oxygen-glucose deprivation (OGD) injury in neurons. Whether the mechanisms of calycosin against cerebral ischemia injury are consistent with the following hypothesis? Namely, the mechanisms of calycosin are by inhibiting calpain activation, preventing TRPC6 proteolysis and strengthening the expression of pCREB. To answer this question, our research will investigate the protective effect and molecule mechianism of calycosin on cerebral ischemia injury, specifically the key role of TRPC6/CREB pathway. Representing the mechanisms of calycosin will contribute to the clinical research and promote the development of modernization of traditional Chinese Medicine.

黄芪具有补气行血的特点，常用于缺血性脑卒中的治疗。毛蕊异黄酮是黄芪中的重要活性成分，我们前期的研究已经证明毛蕊异黄酮具有抗脑缺血损伤的作用，但具体的作用机制仍然不清楚。近来的研究提示：脑缺血损伤后，抑制钙超载介导的calpain活化，阻止其对TRPC6蛋白的降解以及增强pCREB的表达是一条重要的生存通路。我们的预实验结果表明毛蕊异黄酮能够显著抑制神经元氧-糖剥夺损伤后calpain的活化。那么毛蕊异黄酮抗脑缺血损伤的机制是否也符合以下的假说？即毛蕊异黄酮通过抑制calpain活化、阻止其对TRPC6蛋白水解和增强pCREB蛋白的表达，从而发挥抗脑缺血损伤作用？回答这个问题，本课题将研究毛蕊异黄酮对脑缺血损伤的保护作用及其分子机制，尤其是TRPC6/CREB通路在其中所起的关键作用。阐明这个问题，将有助于毛蕊异黄酮的临床研究，从而推动中药现代化的发展。

毛蕊异黄酮是黄芪的主要活性成分，我们前期研究首次发现毛蕊异黄酮能够显著减小大鼠脑缺血/再灌注损伤后的脑梗死面积，促进神经功能的恢复，这表明毛蕊异黄酮具有抗脑缺血损伤的作用，然而具体的分子作用机制仍然没有研究清楚，尚待进一步研究。脑卒中的病理生理机制非常复杂，钙超载被认为是脑缺血损伤后氧化应激、炎症反应和细胞凋亡等一系列反应的共同途径。研究发现Ca2+超载后，其下游的钙依赖性蛋白酶-卡配因（calpain）也被激活。Calpain的活化，将会导致缺血脑组织中的非选择性阳离子通道，即瞬时受体阳离子通道6（TRPC6）蛋白的降解。研究也证实，抑制calpain对TRPC6蛋白的降解在促进神经细胞的生存方面起着重要作用。此外，TRPC6还能通过Ca2+/CaM/CaMK通路激活c-AMP效应结合蛋白（CREB）的表达，而p-CREB蛋白表达水平的上调能够显著抑制神经元细胞的凋亡。这些研究结果提示：脑缺血损伤后，抑制钙超载介导的calpain活化，阻止其对TRPC6蛋白的降解以及增强p-CREB的表达是脑缺血损伤的一条重要生存通路。我们的预实验结果表明毛蕊异黄酮能够显著抑制神经元细胞缺糖氧/复糖氧损伤后calpain的过表达。那么毛蕊异黄酮抗脑缺血损伤的作用机制可能与这条通路有关吗？回答这个科学问题，本课题将深入研究毛蕊异黄酮对脑缺血损伤的保护作用及其分子机制，尤其是TRPC6/CREB通路在其中所起的关键作用。我们的研究结果表明：在动物实验上，毛蕊异黄酮能够通过改善神经功能学、减轻脑梗死面积、降低神经细胞死亡和凋亡，且能抑制calpian-1的活化、增强TRPC6和p-CREB的表达；给予TRPC6抑制剂后，毛蕊异黄酮抗脑缺血损伤作用被逆转。在细胞实验上，毛蕊异黄酮能够显著提高神经元OGD损伤后的生存率、抑制Ca2+离子浓度、增强TRPC6和p-CREB mRNAs和蛋白水平的表达，将TRPC6和p-CREB基因沉默后，毛蕊异黄酮对神经元细胞OGD损伤诱导的生存率下降无明显抑制作用。体内外实验充分证实：黄芪中的毛蕊异黄酮通过抑制钙超载诱导的calpain活化，阻止其对TRPC6蛋白的降解以及增强下游p-CREB蛋白的表达发挥抗脑缺血损伤的作用。本研究结果不仅揭示毛蕊异黄酮抗脑缺血损伤的作用机制，也为临床也为临床有效应用毛蕊异黄酮治疗缺血性脑卒中提供了理论指导。