Nogo-B调控肺泡上皮向间质转化在肺纤维化中的作用及其机制研究

Epithelial mesenchymal transition (EMT) plays an important role in the development of the lung fibrosis. Our preliminary experiments have shown that Nogo-B, a family member of reticulon protein family 4, is involved in the pathological process of the condition. Based on the hypothesis that Nogo-B promotes lung fibrosis through regulating EMT of the alveolar epithelial cells (AECII), we designed the following research. In this study, we will observe the enfluence of Nogo-B on the fibrotic extent and EMT of AECII using the technology of Nogo-B adenovirus and siRNA interferon to up or down-regulate the level of Nogo-B expression from the wide type mice and Nogo-B knock out mice in the stimulation of LPS or bleomycin. In the mean time, we will isolate the AECII by GentleMACS to study the shape and function of AECII in the different level of Nogo-B expression. Finally, A549 and MLE-12 will be used to explore the mechanism of EMT regulated by Nogo-B. The present study will be of great help to understand the role of Nogo-B in modulation of EMT in lung fibrosis and to provide a new strategy in prevention and treatment of the disease.

肺泡上皮细胞向间质细胞转化（EMT）在肺纤维化的发生、发展中起关键作用。预实验提示网状蛋白家族4成员中的Nogo-B参与了肺纤维化的病理生理过程。基于Nogo-B通过调控肺泡上皮细胞EMT而促进肺纤维化的假设，本研究拟选用WT和Nogo-B-/-小鼠以及A549和MLE-12细胞，分别采用LPS和博来霉素诱导肺纤维化模型，利用GentleMACS磁珠分离肺泡上皮细胞、以及Nogo-B腺病毒转染高表达、siRNA干扰等技术，观察调控Nogo-B表达对肺纤维化小鼠的纤维化程度以及EMT的影响，同时观察肺泡上皮细胞功能和形态的变化；在此基础上，进一步采用体外细胞培养技术，探讨Nogo-B调控EMT的分子机制以及信号通路，力求阐明Nogo-B参与肺纤维化的发生发展是通过调控EMT而实现的这一科学假设，以期为阐明临床肺纤维化的发病机制及临床救治提供新的思路。

特发性肺纤维化是临床常见的间质性肺疾病，严重危害人类健康，被称为“不是癌症的癌症”。临床上缺乏有效的治疗手段，预后差，中位生存期3-5年。因此，针对肺纤维化的发病机制进行深入研究，并阐明其关键的调控环节，发掘潜在的治疗靶点，对于提高患者生存率及改善生活质量等有着十分重要的意义。预实验提示Nogo-B极有可能参与了肺纤维化的病理生理过程。本课题分为3个研究内容，第一，明确肺纤维化小鼠肺组织及上皮细胞中Nogo-B 的表达变化规律；第二，调控Nogo-B 对上皮间质转化的影响及其在肺纤维化中的作用；第三，初步阐明Nogo-B调控肺泡上皮细胞EMT的可能机制。通过体内实验发现，相较于正常小鼠肺组织，Nogo-B的表达水平在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织中显著增高，提示Nogo- B参与了肺纤维化的病理生理过程，并在其发生发展过程中发挥了重要作用。为了明确Nogo-B在肺纤维化进展中的作用及其地位，采用Nogo-B高表达腺病毒转染及siRNA干扰等技术调控Nogo-B表达观察肺部的纤维化程度。结果发现高表达Nogo-B组肺组织病理损伤更为严重，且胶原纤维含量及在肺部的沉积明显增多，肺组织及BALF中的TGF- β及炎症因子TNF-α，IL-1β，IL-6分泌增多；而Nogo-B低表达组小鼠的肺纤维化程度明显减轻。在此基础上我们以Nogo-B基因敲除小鼠和正常小鼠为实验对象，在Nogo-B的不同表达水平下，观察肺泡上皮细胞的的功能和形态变化，如炎症因子分泌、凋亡信号通路，EMT中的关键分子紧密连接蛋白ZO-1、occludins蛋白，上皮细胞表型E-cadherin，SPC等及间质细胞表型vementin、fibronetin、α-SMA的表达水平，以明确Nogo-B对于EMT的影响。结果发现，正常小鼠的肺泡上皮细胞表型明显向间质分化，且细胞凋亡数明显增加。在此基础上，进一步采用体外细胞培养技术明确Nogo-B调控EMT的分子机制很有可能通过ERS/PERK通路实现，揭示了Nogo-B调控肺泡上皮细胞向间质转化在肺纤维化发生、发展中的机制作用。上述研究成果在国内外均未见有报道，Nogo-B可能为阐明临床肺纤维化的发病机制及临床救治提供新的思路。