嗜热菌Thermus thermophilus HB8铁硫簇SUF合成途径的研究

铁硫簇广泛分布于古细菌、细菌、真核生物中，参与电子传递、酶活的调控等重要生物功能。铁硫簇生物合成途径至少有三个系统NIF、ISC和SUF，都由脱硫酶催化半胱氨酸脱-SH提供硫原子，由铁载体提供铁原子，在骨架蛋白（scaffold）上进行组装并将铁硫簇转移到受体蛋白的脱辅基蛋白（Apo-protein）上形成全蛋白（Holo-protein）后行使生理功能。嗜热菌Thermus thermophilus HB8中存在较为完整的SUF体系，是进行铁硫簇SUF合成途径研究的很好材料，而且嗜热菌蛋白具有热稳定性，有利于体外蛋白纯化及晶体生长。本项目意在结合嗜热菌蛋白特性，在体外研究SUF系统中尚未解决的问题，几种可能的骨架蛋白的结构与作用机理以及在铁硫簇组装过程中涉及的蛋白质的相互作用所形成的蛋白复合体的结构和功能的探讨。为下一步系统性了解SUF系统的作用机理奠定基础。

铁硫簇是一种古老且很重要的无机辅因子，广泛存在于各种基础生命活动中，在细胞的生物学过程中起着重要的作用，可参与电子传递和基因调节等过程。现已发现细菌中主要铁硫簇合成途径有三种类型，即为ISC，NIF和SUF系统。ISC系统由iscSUA-hscBA-fdx基因串编码，合成的是一类“管家”蛋白，适于在正常条件下表达。NIF系统由nifSU基因编码，适于固氮酶（厌氧条件下起作用）铁硫簇的合成。SUF系统由基因串sufABCDSE编码，常在恶劣环境如氧化应激和铁饥饿条件下表达。但是在Thermus thermophiles HB8 中存在较为完整的而且唯一的SUF体系，是进行铁硫簇SUF合成途径研究的很好材料。SUF途径主要包括sufABCDSE这样一个基因簇，分别编码SufA、SufB、SufC、SufD、SufS和SufE这六种蛋白。.本课题以Thermus thermophiles HB8全基因组为模板，通过PCR技术，分别获得sufA、sufB、sufC、sufD、sufS、sufE基因，并成功将目的基因分别连接到表达载体pET28a(+)和pGEX-6P-1上，构建重组质粒。重组质粒转化E.coli BL21后，获得大量表达，通过亲和层析与蛋白凝胶过滤层析等方法将其分别纯化。并通过共表达和共转化等方法成功表达复合体SufBC、SufCD、SufBCD蛋白。.对蛋白的功能研究表明：SufS具有半胱氨酸脱硫酶活性，SufE没有脱硫酶活性，但SufE存在会使SufS活性增强，摸索体外重组的条件发现在60 ℃孵育1.0-2.5 h效果比较好，其活性是单体SufS的2倍左右；SufC蛋白具有ATP水解酶活性，使用一个三偶联的方法测定SufC ATPase活性。 SufC可以与SufB，SufD相互作用形成复合体SufBC，SufCD，SufBCD。这些复合体的形成均可以提高SufC ATPase活性。同时在复合体SufBCD 存在时，SufS半胱氨酸脱硫酶的活性也被提高。.体外重组实验表明：SufS与SufE可在体外重组为复合体，但是通过非共价键连接的，暂时的，不利于复合体的获取。而通过交联剂Mts-Atf-Biotin使SufS与SufE共价交联后，不仅复合体SufSE稳定性增加，而且半胱氨酸脱硫酶的活性亦大大增加，此时SufSE酶活性是单体的6倍左右，活性可持续72小