噬菌体基因组难测序之谜与细菌免疫机制研究

噬菌体基因组虽然很小，但实践中发现对噬菌体基因组的测序常常遇到难以逾越的困难。我们前期采用ABI3730测序仪对噬菌体PaP1进行测序时也遇到同样的困难，后采用新一代454测序仪克服了这一障碍。基于两种方法的测序原理和前期预试验，我们提出这样一种假说："难测序噬菌体基因组DNA内存在某些稀有碱基，而宿主菌体内存在专门识别和降解含稀有碱基DNA的限制性核酸切割酶如EndoV，在构建DNA文库时，进入宿主菌的含稀有碱基的DNA片段被降解, 导致测序或克隆失败"。这一假说的实验验证，可以揭开噬菌体基因组难测序之谜；并阐明细菌EndoV限制性免疫排斥外来核酸侵染的分子机制。在此基础上，我们将敲除工程菌DH5α 菌株的EndoV基因，构建EndoV基因缺失的工程菌株，为含稀有碱基的难测序基因组的测序和克隆工作提供专用工具和解决方案。

全基因组测序是理解物种遗传信息、基因功能、生物学特性及生存机制的重要途径。目前测序百万碱基级别的基因组已经比较容易了。然而，我们却遭遇了一株基因组难以测序的铜绿假单胞菌噬菌体PaP1，“鸟枪法”测序难以解析此噬菌体的基因组序列。本研究通过三代不同的测序技术，终于成功完成了全长91,715 bp的PaP1基因组解析。基于PaP1基因组的比较分析，我们将铜绿假单胞菌噬菌体PaP1、JG004、PAK_P1及vB_PaeM_C2-10_Ab1确定为一个铜绿假单胞菌肌尾噬菌体新属，命名为PaP1样噬菌体属。单分子实时（SMRT）测序结果显示PaP1基因组含大量修饰碱基(7557 个，占全部碱基的8.24%), 其中51个为6-甲基腺嘌呤（m6A），152个为4-甲基胞嘧啶（m4C），其余为修饰类型尚不清楚的修饰碱基。我们的研究结果表明：大肠杆菌DH5α 含有能识别修饰碱基的Endo V酶，在“鸟枪法”建库过程中，该酶识别并降解了含有修饰碱基的插入片段，导致PaP1基因组“鸟枪法”测序的失败。解决此问题的策略有二：一是使用不依赖于构建“鸟枪法文库”的测序技术（如454测序），二是使用大肠杆菌DH5α的nfi-突变株作为“鸟枪法”克隆建库的宿主菌。本研究首次报道了细菌通过Endo V酶学活性实现排除外来DNA侵染、保持自身遗传稳定性的新的免疫机制。由于Endo V同时具有核酸内切酶和外切酶活性，它对插入片段的破坏性特别大，故Endo V在细菌免疫中具有极为重要的作用。.　　在本课题形成论著4篇，其中2篇SCI论著和1篇中文论著已正式发表，1篇SCI论著已完成撰写，正在投稿中，获授权国家发明专利1项，培养博士研究生1名，硕士研究生1名。