铜绿假单胞菌耐受噬菌体PaP1突变频率及耐受机制研究

突变、选择与耐受性的形成是遗传学中的基本问题之一。在细菌耐药性日趋严峻的今天，人们把目光投向了细菌的天敌噬菌体。"噬菌体治疗"有可能成为人类抗感染的又一有用武器。然而，噬菌体治疗也会象抗生素那样，面临耐受性问题。有迹象显示，细菌对噬菌体似乎比抗生素有着更高耐受发生频率。但迄今尚未见在同一条件下对细菌耐受噬菌体与耐受抗生素突变频率的比较研究，对细菌耐受噬菌体的机制更是鲜有关注。我们长期坚持噬菌体研究方向，分离鉴定了对铜绿假单胞菌有强裂菌性的噬菌体PaP1, 完成了其基因组解析,并试图通过基因工程改造，扩展其宿主谱，使之成为相对"广谱"的噬菌体。本项目拟对细菌耐受噬菌体和耐受抗生素的突变率进行比较研究，并阐明细菌耐受噬菌体PaP1的分子机制。评估噬菌体治疗是否具有前景？噬菌体PaP1是否可以发展成为一个抗感染制剂？该工作也可为其他细菌感染的噬菌体治疗提供重要借鉴和理论依据。

本课题以裂解性噬菌体PaP1及其宿主铜绿假单胞菌PA1为模型，分别研究了细菌PA1耐受噬菌体的突变频率、耐受机制以及噬菌体PaP1感染细菌的机制，获得以下结论：. 1. 测出宿主菌PA1耐受噬菌体PaP1的突变频率约为3.02X10-5.. 2. 发现了宿主菌一种新的噬菌体耐受机制：首先，以噬菌体PaP1感染宿主铜绿假单胞菌Pa1, 筛选出噬菌体耐受菌株。该菌株除具有噬菌体耐受性外，其菌落颜色由白色变异为棕色。该变异株命名为PA1r 菌株。 随后，我们对噬菌体敏感的亲本株PA1和耐受株PA1r 进行了全基因组测序和比较基因组学分析。发现PA1r 基因组中丢失了一段219.6KB的片段，其中包含了192个基因。进一步研究发现，192个基因中的galU基因丢失，会导致宿主的噬菌体耐受。深入研究发现，galU基因为细菌合成LPS中的关键基因，galU基因丢失导致宿主菌表面失去LPS，宿主菌变得不能再与噬菌体相吸附，进而导致噬菌体耐受，这表明细菌PA1与噬菌体PaP1结合的受体是LPS。在galU基因的上游，同时丢失的还有 hmgA基因。该基因的丢失，导致一种棕色底物尿黑酸的积累，致使突变菌表现为棕色菌落。LPS是噬菌体PaP1的受体，LPS的丢失导致噬菌体结合受体的丢失，因此噬菌体无法吸附上PA1r。我们将细菌通过丢失一个大片段，因而丢失噬菌体结合受体，从而变得耐受噬菌体的新机制称为“断臂求生”。 . 3. 鉴定了噬菌体PaP1与宿主结合的“受体结合蛋白”（receptor binding protein, RBP)是尾丝蛋白(tail fiber) 。我们发现铜绿假单胞菌噬菌体PaP1和JG004的基因组序列非常相似，但是两个噬菌体的宿主却不同：PaP1感染PA1，而JG004感染PAO1。通过对尾丝蛋白的系统突变技术，发现噬菌体JG004的尾丝蛋白的一个点突变后使得其可以同时感染PA1和PAO1。 而将PaP1的尾丝蛋白替换为JG004的尾丝蛋白后，“重组的噬菌体PaP1” 完全改变了其宿主特异性，可以感染细菌PAO1了。由此，我们确定了铜绿假单胞菌噬菌体的尾丝蛋白是吸附宿主的RBP。通过对该蛋白的遗传改造，可改变噬菌体的宿主谱，这为噬菌体治疗研究奠定了基础。