感染犬流感病毒的宿主miRNAs和mRNAs数据库构建及RIG-I样通路研究

Canine influenza virus, as Influenza A virus, could cause a serious acute respiratory disease in dog. In recent years, scholars began to focus on the dangers of canine influenza virus on the human security as previously reports due to the separation of some novel canine influenza virus as H5N1, H3N1, H1N1 types in dogs. Canine influenza virus infection in dogs, firstly stimulate the natural immune response such as toll-like receptors, RIG - I like receptor responses, further to start the defense mechanisms. At the same time, in the microRNAs, as a member of small RNAs, are also involved, exhibited to the very important regulated-function in whole life process..This study aims to explore the micoRNAs (miRNAs) and mRNA expression profile in beagles artificially infected with H5N1 and H3N2 canine influenza virus infection in different time. Analysis of the relationship between miRNAs and mRNAs of differential expression establish a highly pathogenic (H5N1) and low pathogenic (H3N2) canine influenza virus RNA RNAs (miRNAs, mRNA) database in the beagles. Meanwhile, this study explore the correlation between miRNAs and the innate immune mechanisms (RIG - I like receptor pathway), which would contribute to monitor and prevent canine influenza virus epidemic.

犬流感病毒具有流感病毒的一般特性，近年来随着H5N1、H3N1、H1N1等流感病毒在犬身上的分离，学者们开始思考犬流感病毒在人类安全上的危害。犬流感病毒感染犬后，首先刺激机体做出天然免疫应答反应（启动Toll样受体、RIG-I样受体等应答），进一步刺激机体启动防御机制。同时机体内非常重要的功能成员microRNAs也参与其中。本课题旨在探究H5N1和H3N2 犬流感病毒感染比格犬后，在不同病程中，宿主micoRNAs (miRNAs)、mRNA表达谱的差异性分析，及相关基因功能信息学分析，分析不同miRNAs 与病症相关mRNAs的相互关系，建立高致病性（H5N1）和低致病性（H3N2）犬流感病毒在宿主中RNA（miRNAs、mRNA）数据库。同时从宿主本身出发，探索miiRNAs在宿主天然免疫机制中（RIG-I样受体通路）的角色，为后期更好地监测和预防犬流感病毒的流行提供理论依据。

犬在感染犬流感病毒（CIV）后，机体会通过调节microRNA（miRNA）和基因做出抗病毒感染应答。基于高通量测序技术，对感染CIV H5N1和H3N2的犬肺脏组织和气管组织进行测序，构建犬流感病毒感染后的犬宿主miRNAs和mRNAs数据库。经过生物学统计分析和荧光定量PCR验证，本研究发现22515个mRNA和455个miRNA的变化，其中对比分析H3N2和H5N1感染组的数据，发现存在151个与集体免疫反应相关的差异表达的基因，且与RIG-I样受体通路存在联系。为了探索RIG-I样受体通路在CIV感染过程中的抗病毒作用，本研究在MDCK细胞上过表达犬RIG-I和MDA5，通过荧光定量PCR、双荧光素酶检测、蛋白免疫印迹、基因沉默和病毒生长曲线测定等方法，验证了RIG-I和MDA5通过CARD功能域进行信号转导并激活RIG-I样受体通路诱导干扰素的抗病毒作用，以及提高下游的干扰素促进基因表达的作用。已有相关报告指出流感病毒蛋白能与RIG-I样受体发生相互作用，从而抑制其通路激活的抗病毒作用，为了进一步探究犬RIG-I样受体通路和CIV之间的关系，本研究通过间接免疫荧光、双分子荧光互补和免疫沉淀技术验证了RIG-I和MDA5均能与CIV的PB2、PB1、PA、NP和NS1蛋白发生互作，且首先证实了RIG-I能与M1、M2蛋白发生互作，其互作的关键结构域为CARD功能域。综上，我们成功构建了宿主感染犬流感后的miRNAs和mRNAs数据库，验证了RIG-I和MDA5在犬流感感染过程中起到积极的抗病毒作用，并发现了部分病毒蛋白能与RIG-I或MDA5发生相互作用，对CIV感染宿主的病理机制提出新见解和提供了一定的理论依据。