Toll样受体2/4对缺血脑组织中干细胞的调控作用

Toll-like receptors (TLRs), a family of signal transduction molecules, play a critical role in the induction and regulation of immunity and inflammatory responses. Recently, studies and our preliminary experiment revealed that TLR2 and TLR4 play a different role in regulation of maturing process of stem cells, including neural stem cells (NSCs) and bone marrow stem cells (BMSCs). Based on the reports and our observation, we hypothesize that TLR2 and TLR4 play a different role in the maturing process of stem cells in the ischemic brain. To evaluate our hypothesis, we will use gene knockout mice, and the methods of immunohistochemistry (IHC), molecular biology, behavioral testing, and imaging, to investigate the regulation of TLR2 and TLR4 on 1. endogenous NSCs, 2. exogenous NSCs, and 3. transplanted BMSCs in the ischemic brain. This project will provide the following important and innovative information: 1. The exact role of TLR2 and TLR4 in proliferation, migration, differentiation, and survival of endogenous NSCs, exogenous NSCs, and BMSCs in the ischemic brain; 2. Which is mainly responsible for their action of effect: the TLR2/4 in stem cells or the TLR2/4 in the ischemic brain? 3. Whether modification of TLR2 and TLR4 will manipulate maturing processes of stem cells and enhance the effect of cell-based therapy. This proposal may lead to the development of novel management strategies for ischemic stroke.

Toll样受体（TLRs）信号转导分子家族在诱导和调节免疫炎症反应中起重要作用。近来的研究和我们的预实验发现TLR2和TLR4调控神经干细胞（NSCs）及骨髓间质干细胞（BMSCs）的成熟过程。我们假设：TLR2和TLR4对缺血脑组织内的干细胞起调控作用。为验证这一假设，本课题将应用基因敲除小鼠及组织化学、分子生物学、功能学和影像学方法，研究TLR2和TLR4对1.内源性NSCs、2.外源性NSCs和3.移植的BMSCs在缺血脑组织内的增殖、迁移、分化、存活和功能发挥的调控作用和机制。并将提供以下重要和创新的发现：1.TLR2 和TLR4对缺血脑组织内NSCs和BMSCs成熟各环节的确切作用；2.是干细胞本身的TLR2/4，还是脑组织内的TLR2/4在其调控作用中起主导地位；3.通过修饰TLR2/4可以控制干细胞的成熟过程、增强细胞疗法的效果，为缺血性脑血管病的治疗提供新的措施。

Toll样受体（TLRs）介导的信号转导通路在触发和调节免疫炎症反应中起重要作用。而免疫炎症反应在内源性神经再生和外源性移植的干细胞的迁移、存活和分化中起重要作用。本课题应用野生型及TLR2基因敲除和TLR4基因敲除小鼠建立大脑中动脉区脑缺血模型，通过标记内源性神经干细胞及侧脑室注射分离培养的外源性骨髓间充质干细胞（BMSCs）和神经干细胞（NSCs），应用组织学、免疫组织化学、分子生物学、功能学等方法，评估TLR2和TLR4介导的信号通路对缺血脑组织内干细胞的调控作用及机制。实验结果发现：1.脑缺血可以诱发内源性神经干细胞增殖，且多生发自缺血侧脑室管膜下区。TLR2和TLR4基因敲除可以促进缺血脑组织内源性NSCs的增殖和存活，脑组织中自发性神经再生功能提高，改善部分由于脑缺血所致的运动功能缺损。其机制可能与TLR2介导的信号通路参与GSK和Bcl-xl等的调节有关。而TLR4介导的信号通路参与对缺血脑组织内源性神经再生的作用机制有待于进一步探讨。2.脑缺血可以促进BMSCs从注射部位向缺血区域迁移，且多位于缺血侧并聚集在缺血周边区域。与野生型比较，在TLR2基因敲除小鼠缺血脑组织内的BMSCs显著减少，而在TLR4基因敲除小鼠缺血脑组织内BMSCs无显著性变化。3.应用TLR2受体激动剂干预培养的NSCs可以提高其缺氧状态下的存活率。而与对照组相比，应用TLR4拮抗剂未显著改变培养NSCs的存活和分化。此外，TLR4介导的调节蛋白MyD88基因敲除可抑制NFkB的活化及炎症因子的表达，并上调VEGF和干扰因子beta1的表达。结果提示，TLR介导的MyD88依赖性通路参与缺血脑组织内的炎症反应和神经保护作用的调控。4.注射人工合成的外源性TLR4拮抗剂（TAK-242）可以显著抑制下游炎症因子的表达、减小脑梗死体积、促进神经功能的恢复。该课题结果有助于阐明TLRs介导的信号通路参与缺血脑组织中内源性神经再生和外源性干细胞的调控机制，并为应用TLRs抑制剂或拮抗剂治疗缺血性脑损伤、促进本课题从应用基础研究向临床应用的转化提供理论依据和实验基础。