酿酒酵母血红素合成途径胞质重构强化黄酮羟化酶功能

Flavonoids are a group of plant natural products with lots of important physiological functions and applications. Biosynthesis of flavonoids invovles a series of flavonoid hydroxylases (belong to cytochrome P450). These reactions cannot be achieved by non-cytochrome P450 enzyme or common chemical reactions. Previous works showed that the low efficiency of the heterologous production of flavonoids in Saccharomyces cerevisiae largely imputed to the strict regulation of sub-cellular distribution and supply of heme, which is the prosthetic group of flavonoid hydroxylases. Besides, the interactions of heme biosynthesis and other key cell phenotypes and metabolic pathways in S. cerevisiae are still poorly understood. In this project, the biosynthesis pathway of heme, which dispersed in mitochondrion and cytoplasm, were reconstructed in cytoplasm by overexpression the essential enzymes from Escherichia coli. Based on the S. cerevisiae strains with ability to accumulate heme in different sub-cellular compartments to different levels, the collaborative control mechanisms among heme biosynthesis, typical cellular phenotypes, expression and activity of typical flavonoid hydroxylase (flavonoid 3'-hydroxylase and flavonoid 3-hydroxylase), would be demonstrated. The results obtained could provide essential theoretical and technical references for the similar metabolic engineering for the production of complicated metabolites require cytochrome P450.

黄酮类化合物是一类具有重要生理功能和应用价值的植物天然产物。黄酮类化合物合成中需要多个黄酮羟化酶(属于细胞色素P450)介导的单加氧反应，无法采用其他非细胞色素P450酶和普通化学进行替代。研究表明，导致微生物异源合成复杂黄酮类化合物效率较低的关键，在于黄酮羟化酶的表达和活性受其辅基血红素供给和亚细胞分布等的严格调控，而目前对酿酒酵母中血红素的合成与积累，及其对关键细胞表型代谢途径的作用仍然缺乏了解。本项目拟通过表达来源于大肠杆菌中的关键酶，将分散于线粒体和胞质中的血红素合成途径完整重构于胞质中，实现酿酒酵母血红素合成过程的定量调控。利用获得的具有不同血红素亚细胞区间分布和供给的酿酒酵母菌株，阐明血红素代谢与细胞关键表型、典型黄酮羟化酶(黄酮3'-羟化酶和黄酮3-羟化酶)表达和活性的协同调控机制。本项目的研究结果将为类似涉及细胞色素P450的复杂代谢产物的代谢工程改造提供理论与技术参考。

黄酮类化合物是一类具有重要生理功能和应用价值的植物天然产物。黄酮类化合物合成中需要多个黄酮羟化酶(属于细胞色素P450)介导的单加氧反应，无法采用其他非细胞色素P450酶和普通化学进行替代。本项目对酿酒酵母血红素合成过程的定量调控，阐明血红素代谢与细胞关键表型、典型黄酮羟化酶(黄酮3'-羟化酶和黄酮3-羟化酶)表达和活性的协同调控机制。主要研究内包括： (1) 从头合成柚皮素菌株的构建与柚皮素合成限制因素的鉴定。通过诊断表达相关基因，验证了莽草酸途径代谢通量低和PhCHS酶活低是限制柚皮素合成的两个重要限速因素。通过发酵优化最终的工程菌株可以从2.50 g/L对香豆酸合成648.63 mg/L的柚皮素。(2) 利用梯度强度启动子优化柚皮素合成基因的表达水平。为了在酿酒酵母中优化柚皮素合成基因表达水平，从启动子文库中选择30个梯度强度的启动子，分别与柚皮素合成途径基因Pc4CL、PhCHS和MsCHI随机组装，随后通过高通量筛选方法获得最佳菌株，经过发酵优化，改造菌株的柚皮素产量提高到1.21 g/L，为首次获得克级别的柚皮素积累。(3) 基于启动子工程和定向进化技术强化圣草酚合成。从水飞蓟中鉴定出一个全新的高效SmF3´H和与之匹配的SmCPR。通过定向进化技术筛选获得了SmF3´H和SmCPR的高效突变体SmF3´HD284N和SmCPRI453V，最佳菌株可以合成3.28 g/L的圣草酚，是目前已报道的最高产量。(4) 水飞蓟来源黄酮3-羟化酶的鉴定实现黄杉素的高效合成。从水飞蓟转录组中鉴定得到一个高效黄酮3-羟化酶SmF3H，结合对血红素供给过程的优化，最佳菌株可以高效合成3.54 g/L黄杉素，是目前已报道的最高产量。(5) 二氢杨梅素从头合成。从柚皮素到二氢杨梅素的B环的C-3’和C-5’羟基化反应需要F3’5’H的催化，而F3’H能单独催化C-3’的羟基化反应，因此提出F3’H与F3’5’H协同表达提高DHM产量的假设，结合副产物途径的敲除、负反馈抑制解除以及从头合成途径整合实现葡萄糖到DHM从头合成途径的构建。相关结果为代谢工程改造酿酒酵母强化血红素相关的目标化合物合成提供了重要的理论与技术支持。