肝癌相关Treg细胞表面特征性聚糖谱及酶学基础的研究

Treg细胞具有负调节机体免疫反应功能，是肝癌免疫调节的一个重要方面。研究肝癌相关Treg细胞表面特征性聚糖谱和糖基转移酶调控机制对其细胞功能的影响,就可以从糖生物学角度揭示Treg细胞在肝癌发生发展过程中的作用。本研究使用凝集素芯片和糖基转移酶芯片，高通量、整体上检测肝癌相关Treg细胞表面特征性聚糖谱及糖基转移酶谱调控机制，进而研究肝癌相关Treg细胞特征性糖基化对其趋化、增殖、免疫调节等生物学特性的影响，探索Treg细胞特征性糖基化及糖基转移酶调控机制对肝癌诊断、治疗的理论和实践意义。本研究预期成果将从糖生物学角度为肝癌的诊断和治疗提供新的思路，为肝癌免疫相关药物靶点的设计及肝癌发生发展糖组学分子机理的全面阐明提供理论和实验上的依据，对于肝癌的预防、监测、预后判断具有十分重要的意义。

本研究首次采用四色荧光标记流式细胞仪分选出CD4+CD25+CD127low/-CD49d- Treg细胞，获得有活性、FoxP3高表达、高纯度Treg细胞，可体外培养用于下游实验。研究发现HCC患者外周血Treg细胞占整个CD4+ T细胞比例显著高于健康对照，HCC癌灶Treg细胞数量显著高于癌旁对照，而且表达较高的免疫抑制表型，免疫抑制功能也更强，扩增后的细胞仍保持较高抑制表型。使用Agilent全基因芯片杂交结果显示HCC癌灶浸润Treg细胞相对于癌旁肝组织浸润Treg细胞共有1032个基因表达上调，1357个基因表达下调。GO分析显示癌灶浸润Treg细胞相对于癌旁肝组织Treg细胞有431条GO条目上调，237条GO条目下调。PATHWAY结果显示两组间有7条上调通路和9条下调通路差异，锚定糖基化磷脂酰肌醇通路、唾液酸分泌通路涉及到HCC相关Treg细胞的糖基化改变。构建凝集素芯片检测Treg细胞膜表面特征性聚糖谱，发现HCC患者外周血Treg细胞与健康对照组相比，表面α1-6岩藻糖、α1-6甘露糖、GalNac、β型半乳糖链、复杂型N-聚糖增加。研究也提示HCC微环境中的galectin-1可能促进Treg在HCC中扩增，进而影响HCC预后。凝集素芯片显示肝癌细胞株HCCLM3相对于Hep3B，代表唾液酸MAL-Ⅰ&II等、代表岩藻糖PSA、LCA等、代表甘露糖ConA、GNA等、代表GlcNAc的PHA-L等凝集素点信号明显增加；代表半乳糖链BPL、EEL等凝集素点信号增加。糖基转移酶PCR芯片显示HCCLM3较Hep3B，ST3Gal1、FUT8和MGAT5等转移酶表达增高。ST3Gal1对MAL-Ⅰ&II，FUT8对PSA、LCA， MGAT5对PHA-L，不同转移潜能肝癌细胞株糖基转移酶表达符合其特征性糖基化差异，因此细胞功能也受糖基转移酶ST3Gal1、FUT和MGAT5等调控。HCC细胞表面糖基化改变，可能使HCC细胞表面性质变化及细胞分泌因子或蛋白改变，是造成HCC细胞粘附、侵袭和转移能力增强的重要原因。HCC相关Treg细胞膜相似的特征性糖基化和细胞免疫抑制功能变化，提示同样情况也可能发生在Treg细胞，唾液酸转移酶ST3Gal1和岩藻糖转移酶FUT8之间相互作用的免疫信号通路可能对HCC细胞免疫逃逸也起着重要的作用。