肿瘤相关性中性粒细胞来源的CCL17介导Treg细胞浸润促进肝癌转移复发的机制研究

Tumor-associated neutrophils (TANs) play a crucial role in carcinogenesis and cancer progression. We have isolated TANs from Hepatocellular carcinoma (HCC) microenvironment and screened their specific secreted cytokines by using chemokine/cytokine array, and recently found that TANs in the HCC microenvironment have a powerful ability for recruiting T regulatory cells (Treg) in a CCL17 dependent manner. In this study, we firstly plan to identify by in vitro and in vivo study, the key chemokine/cytokine CCL17 inducing Treg recruitment which involved in the metastasis and recurrence of HCC and then explore the molecular mechanism regulated by HCC microenvironment. Finally, using tissue microarrays (TMAs) and immunofluorescence in HCC samples, we will determine the relationship between neutrophils and Treg infiltration, and evaluate their prognostic significance. Through the above research, we will determine the effect and mechanism of TANs in recruiting regulatory T-cells infiltration in the HCC microenvironment, and provide experimental evidence for exploring the new intervention targets on the metastasis and recurrence of HCC.

最近研究表明肿瘤微环境中浸润的中性粒细胞在肿瘤发生发展过程中起到至关重要的作用。前期工作中，通过趋化因子/细胞因子PCR阵列筛选并证实在肝癌中肿瘤相关性中性粒细胞(TANs)高表达趋化因子CCL17；细胞体外趋化实验证实CCL17是参与TANs趋化Treg细胞，并诱导癌内浸润的关键趋化因子。本课题拟首先通过体外细胞功能试验和体内小鼠肝癌成瘤试验，明确TANs分泌的CCL17在肝癌生长和转移过程中的重要作用；然后应用磷酸化蛋白芯片以及western blot、ELISA检测，分析肝癌微环境诱导TANs分泌CCL17的关键信号通路；最后在肝癌组织样本中进行免疫组织化学和免疫荧光检测，观察TANs、CCL17以及Treg表达和定位的关联性，并对其预后价值进行评价。通过以上研究，明确TANs通过分泌CCL17介导Treg浸润，促进肝癌转移复发的作用机制，为探讨肝癌治疗中新的干预靶点提供依据。

肿瘤是种子（癌细胞）在适宜的土壤（细胞间质）中生长的结果。肿瘤微环境是由多种间质细胞和癌细胞组成，中性粒细胞作为肿瘤微环境中一个重要炎症细胞，参与调控肿瘤的侵袭与转移。课题组前期报道肝癌细胞通过分泌趋化因子CXCL5介导中性粒细胞浸润，促进肝癌转移复发。本次研究，首先通过细胞因子/趋化因子PCR 芯片筛选，发现肝癌中肿瘤相关性中性粒细胞（TANs）高丰度分泌细胞因子CCL2 和 CCL17；在肝癌细胞株和小鼠移植模型中证实，TANs 分泌CCL2招募巨噬细胞，同时分泌CCL17介导调节性T细胞（Treg）浸润，三者共同促进肿瘤生长、血管生成以及侵袭转移。此外，体外细胞共培养实验表明肝癌细胞通过激活正常中性粒细胞的PI3K/Akt 和 p38/MAPK信号通路，使其"驯化"为TANs，进而分泌细胞因子CCL2 和 CCL17。值得注意的是，研究者发现索拉菲尼治疗引起缺氧，诱导肝癌细胞通过HIF1α/NF-κB/CXCL5通路招募中性粒细胞浸润，同时抑制其凋亡，因此制约了索拉菲尼的疗效。体内成瘤实验中，研究人员证实封闭中性粒细胞联合索拉菲尼治疗显示出协同抑制肿瘤生长和血管生成作用。最后，肝癌样本中免疫组化分析表明，TANs数目与癌内巨噬细胞和Treg细胞浸润、微血管数目，患者总生存期短以及术后复发显著相关。多变量分析显示，TANs数目或联合癌内巨噬细胞/Treg细胞，是影响肝癌患者术后生存和复发的独立预后指标。该成果以肝癌为研究对象，系统的研究了肝癌微环境中炎症/免疫细胞之间的相互调控及其在肝癌转移复发中的作用与机制，深入探讨了以间质细胞作为潜在肿瘤分子靶点的可行性。2016年6月国际消化病顶级杂志《Gastroenterology》（胃肠病学，IF=18.2）以全文（Original Research）形式正式发表了复旦大学（附属中山医院）肝癌研究所周俭教授研究团队的肿瘤炎症微环境调控肝癌转移复发最新研究成果" Tumor-Associated Neutrophils Recruit Macrophages and Treg Cells to Facilitate Hepatocellular Carcinoma Progression and Resistance to Sorafenib "，项目负责人周正君博士本文为共同第一作者。