超声破坏载基因靶向微泡协同声动力治疗恶性胶质瘤的实验研究

Sonodynamic therapy (SDT), a promising modality for malignant glioma treatment, chiefly depends on cytotoxicity products from a sonosensitizer activated by ultrasound to generate antitumor effects. GSCs are regarded as the key cells for treatment of malignant glioma, and have been identified as suitable targets to design therapeutic agents and test therapeutic efficiency. In our earlier studies, we firstly demonstrated that GSCs are more resistant to SDT-induced cell death, and the resistance of GSCs may be caused by decreased sonosensitizer uptake due to ABCG2 overexpression. For inhibiting the expression of ABCG2, we constructed recombinant adenovirus expressing siRNA specific to ABCG2 gene. In the current study, we intend to prepare liposome microbubbles binded with ligants targted to αⅤβ3 integrin, which specifically expressed in endothelial cells of newly forming glioma vessels. After intravenous administration, we investigate whether target microbubbles could effectively deliver therapeutic genes into solid gliomas in rat brains to decrease the expression of ABCG2 on GSCs under ultrasounic destruction, and increase the antitumor effects of SDT on GSCs/malignant gliomas.

声动力治疗（SDT）是一种新型的恶性肿瘤治疗技术，其通过超声激活肿瘤细胞内的声敏剂产生细胞毒性产物杀伤肿瘤细胞，在恶性胶质瘤治疗领域具有良好的应用前景。胶质瘤干细胞（GSCs）作为恶性胶质瘤的"种子细胞"，是评估各种治疗策略是否有效的"靶细胞"。我们在前期工作中首次证实，GSCs上过表达的ABCG2蛋白可以将细胞内声敏剂外排，降低SDT的治疗效果。因此, 有效地抑制ABCG2蛋白的表达就成为提高SDT对GSCs治疗效果的关键。基于此, 我们在前期工作中成功构建了表达ABCG2基因siRNA的重组腺病毒，为了实现其在胶质瘤内靶向、高效地表达，我们拟制备一种可以靶向胶质瘤血管内皮细胞的载基因微泡，并利用超声破坏流经/滞留于瘤内的载基因靶向微泡，实现目的基因在大鼠脑胶质瘤内的定向转染，从而有效地抑制GSCs上ABCG2蛋白的表达，提高SDT对GSCs/恶性胶质瘤的治疗效果。

我们由U251细胞中成功的分离、培养了胶质瘤干细胞，这些胶质瘤干细胞表达特异性的抗原标记CD133和nestin蛋白，原位移植后可以在大鼠和小鼠颅内形成典型的胶质瘤；为了便于实时动态检测颅内肿瘤的变化，我们构建了可以稳定表达荧光素酶的胶质瘤干细胞系，原位移植后，通过MRI和小动物活体荧光系统可以检测到肿瘤的形成，在各种干预条件下可以实时观察到颅内肿瘤的变化；通过改进制备工艺，成功地制备了纳米级的脂质体微泡，平均粒径为:(560.34±23.12)nm，表面电位均值为:(-14.30±3.71)mV，平均浓度为:(7.8±0.43)×108/mL，24 h 内微泡保持基本的稳定，这些脂质体微泡具有高效的基因搭载率和良好的DNAseⅠ保护作用；重新构建了靶向ABCG2基因的RNAi慢病毒载体，流式细胞术和Western Blot证明新构建的慢病毒载体可以高效地感染胶质瘤干细胞并且可以有效地抑制ABCG2蛋白的表达，逆转胶质瘤干细胞对细胞内声敏剂的外排作用；利用亲和素-生物素法将αⅤβ3-整合素单克隆抗体与携载RNAi慢病毒载体的脂质体微泡链接，形成靶向微泡，小动物活体荧光和肿瘤切片的激光共聚焦显微镜观察证明这些微泡具有良好的体内寻靶能力，经尾静脉注射后可以高效地滞留于脑胶质瘤内，经低频聚焦超声击破后可以对胶质瘤内的细胞实施有效地转染，表达外源性基因和蛋白；将经验证的荷瘤鼠分为5组，分别为对照组、超声辐射组、SDT组、载基因非靶向微泡+SDT组和载基因靶向微泡+SDT组，探讨超声破坏载基因靶向微泡协同SDT对荷瘤鼠脑胶质瘤的治疗作用，Western Blot和肿瘤切片免疫细胞化学染色表明载基因靶向微泡可以明显抑制ABCG2蛋白的表达，TUNEL检测、小动物活体荧光检测、荷瘤鼠生存时间和死亡率的Kaplan Meier曲线表明，载基因靶向微泡+SDT组中，肿瘤内的凋亡细胞数明显高于其他组，肿瘤的荧光强度明显弱于其他组，各组荷瘤鼠的中位生存期分别为22天、23天、25 天、28天以及41天，平均生存天数为20±4天，21±3天，24±4天，29±3天以及42±4天，相比于其他实验组，载基因靶向微泡+SDT组的中位生存时间和生存期明显延长。因此，本研究证实了载基因靶向微泡+SDT对小鼠原位胶质瘤的生长具有明显地抑制作用，这种抗肿瘤效应主要是通过抑制ABCG2蛋白对声敏剂的外排，