Necdin抗神经元凋亡机制研究

Necdin参与神经发育并且在胞浆和胞核中通过下游分子发挥抗凋亡作用。GAPDH是参与糖酵解的一种关键酶，GAPDH不仅参与细胞的正常生理功能，还在多个水平参与细胞的损伤与凋亡过程。我们前期实验发现Necdin与GAPDH可以结合，而Necdin过表达后在缺糖缺氧处理的PC12细胞中有抗凋亡作用，同时GAPDH入核减少，拟开展有关Necdin与GAPDH结合对GAPDH引起的细胞凋亡机制影响的研究。我们将通过定点突变、基因转染后免疫共沉淀方法证实二者结合位点，进而明确Necdin调控GAPDH功能的可能机制。通过免疫细胞化学方法了解Necdin调控GAPDH在细胞内的亚细胞器定位，明确二者的结合在空间上的可能。最后，验证二者结合对细胞内凋亡信号转导有何影响，明确二者结合后的细胞内信号调控机制。本研究将拓展对GAPDH凋亡信号通路的认识，对开展新的抗神经元凋亡措施的研究具有重要意义。

Sirt3 是存在于线粒体中的一种去乙酰化酶， 是目前认为唯一与人类长寿相关的蛋白，大量研究表明，Sirt3 能通过干预多条凋亡信号通路抗氧化应激，延缓细胞衰老， 减少细胞凋亡。 细胞内sirt3 可以调节Siah-1 的表达， 从而调节GAPDH的入核，参与调控细胞凋亡过程。当谷氨酸诱导细胞凋亡，我们发现sirt3的过表达能明显抑制GAPDH 向细胞核内转移，抑制细胞的凋亡；sirt3 表达的下调，能引起GAPDH 入核明显增多，并促进细胞凋亡。研究结果显示，谷氨酸诱导细胞凋亡后，各组细胞内GAPDH 的表达总量未出现明显增多或降低，说明在细胞凋亡的过程中，GAPDH 的表达不受影响，仅通过易位到细胞核诱导细胞凋亡。所以，在细胞应激过程中，sirt3 可以通过作用于siah-1，进而调控siah-1 介导的GAPDH 入核，调控细胞的凋亡。Sirt3 过表达能通过调控GAPDH-siah-1 抑制神经元的凋亡，因Sirt3 主要存在于线粒体中，sirt3 可能在GAPDH-siah-1入核前即与其相互作用，sirt3 可能通过抑制siah-1 的表达，使GAPDH 的入核载体减少，从而阻止GAPDH 的入核，进而不能够触发下游凋亡级联通路，起到保护细胞的作用。.通过iTRAQ技术我们发现高同型半胱氨酸血症的大鼠有着更低水平的降钙素依赖蛋白酶2b（Camk2b）。我们假设Camk2b可能在同型半胱氨酸诱导的凋亡中起到关键作用。结果表明，通过MTT法检测到，高同型半胱氨酸组的神经元相比对照组有着更低的活性、更高比例的凋亡神经元、更低水平的Camk2b mRNA和蛋白的表达。Camk2b过表达组相比对照组，神经元有着更低比例的凋亡和更高的活性。在暴露于二甲氧基雌二醇后，Camk2b过表达的神经元的活性被抑制并出现了更多凋亡细胞。Camk2b组和其他三组中神经元的BCL2、 eNOS、EP300 和 EPO的表达都经过mRNA和蛋白水平的检测。转染Camk2b后，与HIF-1α相关的基因及其下游基因上调，所以Camk2b通过HIF-1α信号通路保护神经元免受同型半胱氨酸诱导的凋亡。HIF在凋亡发生机制的中可能发挥重要作用，进一步分析在凋亡保护和发生过程中HIF-1α信号通路的作用，可能对下一步寻找新的治疗靶点也有一定的启发。