重组谷胱甘肽过氧化物酶及其双功能抗氧化酶的筛选与表达

Glutathione peroxidase (GPX), a selenoenzyme, and superoxide dismutase (SOD) are critical enzymes in antioxidant defense system of living organisms and they can protect cell against oxidative damage, treating many human diseases from oxidative stress by removing reactive oxygen species (ROS). SOD catalyzes the dismutation of superoxide anion (O2o?) to hydrogen peroxide (H2O2), and GPX catalyzes the reduction of H2O2, hydroxyl radical and other harmful peroxides by glutathione (GSH) as the reducer. They not only function in catalytic processes but also protect each other, resulting in more efficient removal of ROS, protection of cells against injury. However, their therapeutic usage is restricted because of the limited sources or instability. Therefore, the preparation of artificial antioxidant enzymes and their mimics has attracted more and more attentions. In this study, we try to establish a high throughout screening platform to obtain the stable human GPXs and their small functional domains with high activities by changing the critical amino acid related to stability or removing some peptide chains based on sequence alignment, molecular docking and human GPX genes expressed in eukaryotes by inserting the selenocysteine insertion sequence into 3' untranslation region of the target gense. Furthermore, we try to design the biofunctional antioxidant enzyme with a delicate dual-activity center and high activities of SOD and GPX by uniting the domains of two active centers into a protein molecule and express them and human GPXs using the novel bacterial bioreactor for selenoprotein induced by MazF.

含硒的谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和超氧化物歧化酶（SOD）是机体抗氧化防御体系的关键酶，能清除体内活性氧，防止细胞过氧化损伤，治疗氧化应激引起的各种疾病。它们以一种协同效应发挥作用，SOD歧化超氧阴离子生成有毒的过氧化氢，再由GPX或过氧化氢酶分解成无害的氧和水，GPX还能分解羟自由基和其它有害的过氧化物。然而，由于天然酶的来源有限或稳定性差，致使人工抗氧化酶及其模拟物的研究备受关注。本项目以硒蛋白的真核表达系统直接表达各型人GPX为基础，通过序列比对、计算机模拟、分子拟合，用定点突变法替换决定稳定性的关键氨基酸或删减肽链的办法，筛选性质稳定的高活力GPX和最小功能域，创建含硒酶高通量筛选的技术平台。通过整合SOD和GPX活性进入同一蛋白分子，设计具有精巧双活性中心的双功能抗氧化酶，探讨用MazF诱导的新型硒蛋白细菌生物反应器高效表达各种性质稳定、高活力的基因工程GPX和双功能抗氧化酶

含硒的谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和超氧化物歧化酶（SOD）是机体抗氧化防御体系的关键酶，能清除体内活性氧，防止细胞过氧化损伤，治疗氧化应激引起的各种疾病。它们以一种协同效应发挥作用，SOD歧化超氧阴离子生成有毒的过氧化氢，再由GPx或过氧化氢酶分解成无害的氧和水，GPx还能分解羟自由基和其它有害的过氧化物。然而，由于天然酶的来源有限或稳定性差，致使人工抗氧化酶及其模拟物的研究备受关注。本项目通过在靶基因的3’端非翻译区引入硒代半胱氨酸插入序列，构建硒蛋白的真核表达系统直接表达各型人GPx，在此基础上通过序列比对、计算机模拟、分子拟合，用定点突变法替换决定稳定性的关键氨基酸等建立高通量筛选的技术平台，经筛选获得了一系列高活力的各型GPx突变体。然后，通过整合SOD和GPx活性进入同一蛋白分子，设计具有精巧双活性中心的双功能抗氧化酶。最后成功用MazF诱导的新型硒蛋白细菌生物反应器高效表达了各种性质稳定、高活力的基因工程重组人GPx突变体蛋白及其双功能抗氧化酶。这些重组人GPx突变体显示出较高的GPx活力，最高达到21268 U/μmol，该活力约为天然牛GPx活力的9倍多。与单独使用缺陷原核表达系统相比，该方法的不仅可以增加蛋白产率、降低生产成本，而且很大程度上提高了蛋白活力。酶促反应动力学研究表明，这些重组人GPx突变体的催化机制与天然GPx相同，均为乒乓机制。因此一定程度上解决了天然GPx来源有限的问题，也将有助于我们对天然hGPx进一步研究及认识。用该系统表达的双功能抗氧化酶在双底物催化上也显示出很好的协同机制。该研究不仅为硒蛋白的表达提供了新方法，而且有助于今后对该类抗氧化酶的开发与应用。