能量限制致鸡脾脏差异表达基因的鉴定与功能注释

Spleen is the biggest poultry peripheral immune organ, which takes part in the cellular immunity and humoral immunity of whole body. Caloric restriction cound improve chicken disease resistance and immune function, but whose biological mechanism was unclear. ①Here we determine to construct caloric restriction model by reducing the dietary caloric intake of broilers, and compare the related immune parameteres of control group and caloric restriction groups; ②screen the differentially expressed genes(DEGs) with GenefishingTM technique among chicken spleens of caloric restriction groups and control group, and clone the unknown spleen DEGs by RACE technology; ③conduct preliminary function analysis of the unknown DEGs through the identification of embryo/tissue spatiotemporal expression characteristics, subcellular localization and dual luciferase report gene detection system; ④conduct gene clustering and pathway analysis; and further conduct the integrated data analysis by combining the gene expression data and the measured immune parameters,to explore the molecular mechanism that the caloric restriction enhances the immune function. The identifition and annotation of DEGs would benefit for the screening of chicken immune molecular marker and the study on the mechanism between the nutrition and epigenetics. As a model animal, the investigation on the DEGs of immune organs in chicken would provide a comparison among species for screening biomarkers affecting human immune function too.

脾脏是禽类最大的外周免疫器官,参与其全身细胞免疫和体液免疫。能量限制可提高鸡的抗病性和免疫机能,但其生物学机制尚不清楚。①本项目拟通过限制能量摄入构建肉鸡能量限制模型，并进行能量限制组与对照组免疫指标的比较分析；②采用GenefishingTM技术筛选能量限制组和对照组肉鸡在脾脏组织的差异表达基因（DEGs），并采用RACE技术克隆脾脏未知差异表达基因；③通过未知差异表达基因的胚胎/组织时空表达特性、亚细胞定位和双荧光素酶报告基因检测,进行其功能的初步实验性研究；④进行基因的功能聚类和通径分析，并结合鸡免疫机能指标进一步进行数据综合分析，探索能量限制增强机体免疫机能的分子机理。筛选和鉴定的差异表达基因，可为鸡免疫相关分子标记的筛选及开展营养与表观遗传的机制研究打下基础。鸡作为一种模式动物，其免疫器官差异表达基因的研究，也可为筛选能量限制影响人类免疫机能的生物标记提供物种间的比较。

脾脏是禽类最大的外周免疫器官,参与其全身细胞免疫和体液免疫，能量限制可提高鸡的抗病性,但其生物学机制尚不清楚。本研究开展了为时7天（22-28日龄）和21天（22-42日龄）的15%和30%能量限制对肉鸡的效应研究。（1）与对照组相比，30%能量限制显著提高了28日龄肉鸡血清IgM和IgA的含量 (P< 0.05)和CD8+淋巴细胞含量(P< 0.05)；42日龄，30%能量限制提高了肉鸡脾脏指数 (P< 0.05)；15%和30%能量限制显著提高了IgG、IgA的含量。（2）以脾脏为研究对象，采用高通量测序技术开展了15%和30%的能量限制对28日龄和42日龄肉鸡脾脏差异表达基因的效应研究。其中28日龄15%能量限制共有26条差异基因，30%能量限制有70条差异基因；42日龄15%能量限制差异基因有141个，而30%能量限制有108个基因差异表达；（3）实时荧光定量PCR验证了31/39个差异基因的表达与高通量测序结果吻合；（4）GO分析发现在28日龄，30%能量限制组差异基因显著富集到趋化因子活性、趋化因子受体结合、细胞因子受体结合、脂肪酸应答、免疫应答、刺激应答及免疫过程这些与免疫及脂类代谢相关的生物学过程；42日龄15%能量限制组和对照组比较，显著富集的差异基因主要参与的生物学过程包括脂类代谢、蛋白质折叠、蛋白质糖基化以及抗原加工提呈等；（5）经过KEGG通路分析发现28日龄15%能量限制组、30%能量限制组和对照组比较差异基因富集通路不显著；42日龄15%能量限制组和对照组比较差异基因显著富集蛋白质内质网加工通路；42日龄30%能量限制组差异基因显著富集于细胞因子和细胞因子受体相互作用通路。这些结果为研究能量限制改善免疫机能的作用机制提供了重要的理论依据；（6） 以UMNSAH/DF-1为细胞模型，通过构建TNFSF13B沉默siRNA载体，探索差异表达基因TNFSF13B的作用机制可能的分子基础结果发现，沉默TNFSF13B基因极显著下调NF-κB和TGFβ mRNA表达，同时免疫印迹试验发现NF-κBp65和NF-κBPp65蛋白表达量极显著下调。以上结果暗示了TNFSF13B调控NFκB和TGF- β基因的表达以及激活NFκB通路是其对机体免疫系统调节的分子水平的作用机制之一。