基于磁纳米微球和金纳米粒子双探针介导的有机磷农药（OPs）检测技术研究

The misuse and abuse of organophosphorus pesticides (OPs) could lead residual excessive of OPs which harm consumer health seriously. The technique for rapid and sensitive detection of OPs is not only the direction of scientific research on pesticide residue control but also the market demand of pesticide residue detection. Based on the previous studies on the immunoassay, this project will focus on following aspects: (1) Synthesis of a variety of OPs generic hapten. Effect analysis of carbon spacer arm length and coupling ratio between generic hapten and carrier protein to specificity of antibody. (2) Hybridoma cell selection by using cell fusion technology and limiting dilution ELISA. Production of generic monoclonal antibody (BS-McAb) specific for OPs. (3) Construction of OPs specific signal amplification probe by coating gold nanoparticles (AuNPs) with BS-McAb and horseradish peroxidase (HRP) enzyme. Relationships investigation of AuNPs diameters and the ratios between HRP and BS-McAb to the sensitivity of the probe. (4) Construction of capture probe based on magnetic nanosphere as solid support. Relationships investigation of the amount of coating antigen, magnetic nanosphere diameter to the reaction kinetics of antigen-antibody. Development of a detection technique for rapid and sensitive detection of OPs based on constructed magnetic capture probe and gold signal amplification probe.

有机磷农药（OPs）的误用、滥用导致农产品中OPs残留超标，严重危害消费者身体健康。OPs的灵敏、快速检测技术不仅是农药残留控制研究的重要方向，也是农药检测市场的迫切需求。本项目在已结题相关检测技术研究的基础上，拟开展以下研究工作：（1）合成多种OPs的通用结构半抗原,分析通用结构半抗原与载体蛋白偶联的碳间隔臂长和偶联比对抗体特异性的影响。（2）采用细胞融合、有限稀释-ELISA技术筛选阳性杂交瘤细胞株，制备OPs的通用单克隆抗体。（3）以金纳米粒子为载体，介导辣根过氧化物酶和通用单克隆抗体，构建高灵敏信号放大探针。探讨辣根过氧化物酶和通用抗体的比例、金纳米粒子粒径与探针敏感性的关系。（4）以磁纳米微球为固相载体包被通用抗原，构建捕获探针。探讨通用抗原包被量、磁纳米微球粒径与抗原-抗体反应动力学的关系。最后基于构建的磁纳米捕获探针和金纳米信号放大探针研究OPs多残留的灵敏、快速检测技术。

有机磷农药（OPs）残留超标，严重危害消费者身体健康。 OPs的灵敏、快速检测技术是维护消费者健康的迫切需求。本项目制备了OPs的广谱性单克隆抗体；构建了金纳米胶囊信号放大探针，AuNP@IgG-bio探针，DNA-CuNPs和AuNP@FAM-dsDNA/IgG探针。创建了OPs的酶联检测、荧光生物传感、生物条形码免疫PCR、双模免疫传感器、LSPR传感器以及“turn off”免疫检测等系列高灵敏快速检测新方法。本项目共发表SCI 收录文论12篇。.具体内容如下：.利用Layer-by-layer技术构建了纳米胶囊信号放大探针，对农产品中吡虫啉的敏感性比传统ELISA高10-1000倍；基于碱性磷酸酶介导的荧光反应系统，对乙草胺等氯乙酰胺类除草剂的灵敏性和线性范围均优于现有免疫检测方法；基于DNA模板化铜纳米颗粒（DNA-CuNPs）的荧光生物传感，对草甘膦的检测仅需14分钟。最低检测限0.47µM, 因为这种生物传感器是在DNA-CuNPs的合成过程中进行的，不需要预先制备纳米材料。基于以AuNPs为载体，介导草甘膦抗体和双链寡核苷酸的AuNPs探针，构建了生物条形码免疫PCR（AuNP-BB-iPCR），对草甘膦的灵敏度比基于同一抗体的传统ELISA高7个数量级。基于AuNP@IgG-bio探针，创建了荧光分光光度计和便携式智能手机读取结果的双模免疫传感器用于检测氯乙酰胺类除草剂，既能满足实验室高灵敏度分析的要求，又能满足临床检测方便性需要。由于AuNP@IgG-bio探针的“广谱性”，该“双模式”策略很容易推广到其他低分子量靶标物的检测；基于HRP介导AuNRs蚀刻的LSPR传感器，对蔬菜、水果和谷物中有机磷农药的敏感性比传统ELISA和电化学方法高12-5000倍；基于G4和卟啉金属化创建了荧光生物传感器，对草甘膦敏感性是HPLC的6倍；以AuNP@FAM-dsDNA/IgG为荧光猝灭探针，基于双重特异核酸酶（DSN）诱导的“turn off”免疫检测，对玉米样品中氯乙酰胺类除草剂的敏感性高于已报导的方法。只需更换包被抗原和相应的McAb，该方案即可应用于其它半抗原污染物的检测。