利用定向进化的β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶防治水稻真菌病的研究

利用PCR技术从水稻、小麦、大豆等几种农作物中克隆β-1，3-葡聚糖酶基因和几丁质酶基因，通过DNA改组技术分别对这两种基因进行突变和重组，构建突变体库。转化受体菌，以水稻纹枯病菌和稻瘟病菌的细胞壁成分制备筛选培养基，定向筛选具有更高降解病害真菌细胞壁活性的克隆。获得的突变体再经几轮改组，筛选出对两种病原真菌有强抑制作用的突变体。对获得的重组菌中所含的β-1，3-葡聚糖酶及几丁质酶基因进行测序，通过生物信息学分析，研究其活性改变的机制。以获得的重组菌作为生防因子，研究其对水稻纹枯病和稻瘟病的防治效果。将经过定向进化的β-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶基因转入水稻，检测转基因植株对纹枯病和稻瘟病的抗性，以获得对这两种真菌病害高抗的植株。

在水稻生产中，由真菌病引起的减产是限制其产量的主要因素。寻找更为有效的防治措施，是水稻生产可持续发展的迫切需要。β-1,3-葡聚糖酶基因及几丁质酶基因在植物抗真菌病基因工程中表现出良好的应用前景。本研究利用 PCR 技术克隆了水稻几丁质酶基因chAB、ch24、小麦几丁质酶基因ch16；水稻β-1,3葡聚糖酶基因gluRC1和小麦β-1,3葡聚糖酶基因gluWH2。利用pET表达系统，实现了几丁质酶基因chAB、ch24和水稻葡聚糖酶基因gluRC1的原核表达，但所表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在。复性后的重组蛋白CHAB、CH24和GluRC1均具有酶活性。CH24和GluRC1对水稻立枯丝核菌（R. solani sclerotia）和水稻稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）有一定的抑菌活性，而CHAB则无明显的抑菌效果。利用pLLP—STII表达载体，实现了几丁质酶基因ch24和水稻葡聚糖酶基因gluRC1的可溶性表达。从海水中筛选到一株高效几丁质降解菌CY1，经鉴定其属于海洋节杆菌。对CY1产酶条件进行了优化，并对CY1几丁质酶基因进行了克隆。利用DNA改组技术，对几丁质酶基因ch24进行了进一步的体外定向进化研究，获得了酶活性提高约5倍的突变体pST-22。利用DNA改组技术，对水稻β-1,3葡聚糖酶基因gluRC1进行了体外定向进化研究，获得了酶活性提高约3倍的突变体pGLUST-11。pGLUST-11联合pST-22对水稻立枯丝核菌和水稻稻瘟病菌有显著的抑菌活性。对获得的重组菌中所含的β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶基因进行测序，通过生物信息学分析，初步分析了其活性改变的机制。以获得的重组菌作为生防因子，对水稻纹枯病和稻瘟病均有一定的防治效果，将分别表达几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因的重组菌同时使用防治效果最好。利用植物表达载体pBI121，构建分别表达几丁质酶基因、β-1,3-葡聚糖酶基因的载体及这两种基因的双价表达载体。将经过定向进化的β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶基因转入水稻，获得的转基因植株对纹枯病和稻瘟病的抗性明显增强，其中转入双价载体的转基因植株对纹枯病和稻瘟病的抗性最好。