表达人E-钙黏素的转基因斑马鱼构建及其在单增李斯特菌感染机制研究中的应用

Listeria monocytogenes (Lm) is a one of the major food-borne pathogens that may lead to severe diseases in humans and ruminant animals. the adhension to human intestinal epitheliar cells is less efficient than that to mice is due to a single amino acid difference of E-cadherin (Ecad). though zebrafish posseses the same key site of Ecad, Oral entered bacteria stucked in the intestine gut without causing infection symptoms in zebrafish embryos. In this project, we hope to generate the transgenic zebrafish line which expressing human E-cadherin specifially in intestine by using Tol2 transposase system and microinjection system and establish an oral infection model for Listeria monocytogenes with this germ-free transgenic zebrafish embryo. By using this model and Listeria inlA deletion strain，we aim to investigate the signaling molecules involved in interaction with InlA-Ecad, bacterial adhesion and engulfment. With analyzing the influences on bacterial proliferation and distrabution of these molecules, we can illustrate the machanism of InlA-mediated Listeria monocytogenes crossing intestinal barrier, which would lay a foundation for further study on the pathogenesis of Listeria monocytogenes and provide a new animal model and a research reference for studying the interaction between pathogen and host.

单增李斯特菌作为四大食源性病原菌之一，能够引起严重的人畜共患病，其在人源肠上皮细胞上的黏附效率比在小鼠上更高，是由于小鼠的E-钙黏蛋白（Ecad）与人的在关键氨基酸上有差异，不能与细菌菌内化素A（InlA）有效结合。尽管斑马鱼Ecad在关键位点上相同，但经消化道感染的细菌大量滞留在肠腔，不能使斑马鱼胚胎出现感染症状。本研究拟利用Tol2转座酶系统通过显微注射构建并筛选出肠道特异表达人Ecad的转基因鱼，建立单增李斯特菌经消化道感染无菌斑马鱼胚胎模型，旨在通过对细菌InlA进行缺失的方法并利用此模型，探索与InlA-Ecad互作、细菌黏附及内吞相关的细胞转导信号及分子，分析其表达对细菌增殖及分布的影响，从而阐明InlA介导的单增李斯特菌突破肠道屏障的分子机制。为进一步探明单增李斯特菌致病机制奠定了基础，为研究病原与宿主之间互作关系提供新型动物模型以及研究参考依据。

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，简称单增李斯特菌）作为四大食源性病原菌之一，在环境中广泛存在，人和动物食用了单增李斯特菌污染的食物后，细菌进入消化道并跨越宿主肠道屏障，随血液循环分布至全身脏器中，或穿过血脑屏障和胎盘屏障造成脑炎和流产等。近年来，斑马鱼越来越多的被应用于感染与免疫的研究中，使用斑马鱼作为宿主，利用其通体透明可实时监测体内病原、体积小数量多可进行大规模筛选，遗传可操作性强等优点，有望更深入地研究脊椎动物免疫系统的功能和传染性病原的致病机制。本项目旨在构建肠道上皮细胞特异性表达人源Ecad（hEcad）蛋白的转基因斑马鱼，模拟单增李斯特菌在自然状态下的感染途径进行建模，从而更好的研究单增李斯特菌突破肠道屏障的机制。本研究通过显微注射技术将表达dsred及hEcad的质粒导入到斑马鱼受精卵单细胞中，通过分子生物学技术及荧光观察筛选，获得了肠道特异性表达dsred及hEcad的斑马鱼幼鱼和肠道特异性稳定表达dsred的转基因斑马鱼Tg (ifabp: dsred)，建立了单增李斯特菌经消化道感染无菌Tg (ifabp: dsred)转基因鱼及表达hEcad幼鱼的感染模型，可作为可视化体内试验模型用于单增李斯特菌与宿主肠道互作机制探究。同时，成功构建了单增李斯特菌内化素A（inlA）缺失株及回补株，体外细胞试验显示，inlA缺失能够影响细菌粘附、侵袭细胞的能力。体内感染结果显示，表达hEcad的斑马鱼幼鱼在感染野生型单增李斯特菌后与野生型AB斑马鱼相比死亡时间略有提前，对感染的鱼进行冰冻切片检测细菌分布发现，野生型细菌感染表达hEcad的幼鱼后不仅分布在肠腔内，且能进入肠上皮细胞，而在Tg (ifabp: dsred)转基因鱼中仅分布在肠腔内，提示hEcad有助于单增李斯特菌突破斑马鱼肠道屏障。而inlA缺失株感染表达hEcad的幼鱼后也仅分布在肠腔内，提示inlA缺失可能导致细菌通过hEcad受体识别入侵肠道的功能受损。以上结果表明，单增李斯特菌突破肠道屏障可能是通过inlA识别hEcad受体这一分子机制入侵肠上皮细胞，从而进一步感染机体。