白菜型油菜角果多室基因mc的克隆与功能分析

Multilocular silique in rapeseed is considered a higher yield related trait, and it is governed by a nuclear recessive gene locus, mc, reported in Brassica rapa L, which hasn't been cloned. In previous study, we resolved mc to an 83.9-kb region in a F2 mapping population of B. rapa. And 4 markers co-segregated with the mc locus and about 16 predicted ORFs were found in the region. In the present project, we will conduct the following works: 1) fine-mapping mc to a region less than 40-kb in a larger F2 population of B. rapa; 2) to identify the variations of important genes between two parents, including the coding sequences and the gene expression level, based on RNA-seq technique; 3) to identify the candidate genes of mc, and perform the complementary test in the multilocular silique parent; 4) to clarify the temporal and spatial expression patterns and the protein subcellular localization of the candidate genes; 5) construction of near-isogenic lines of MC/mc locus for phenotypic comparison; 6) to perform gene expression analysis of mc related genes based on RNA-seq results, which will uncover the genetic regulation mechanism of multilocular silique; 7) cloning and sequence analysis of the mc homogous genes from varieties with multilocular silique in B. juncea and B. napus, which will provide the evolution information of the mc locus in Brassica. These works will help to clone mc successfully, clarify its functions and genetic regulation mechanism of mutilocular silique, which will lay a genetic foundation to the improvement of yield in rapeseed.

油菜多室角果是一种高产相关性状，在白菜型油菜中受1个主效隐性核基因mc的控制，且该基因未被克隆。在我们前期工作中利用白菜型油菜的F2群体将mc基因精细定位到83.9kb的范围；该区段内有4个共分离标记和大约16个基因。在此基础上，本研究拟开展以下工作：1、扩大F2群体，将mc基因精细定位到40kb范围内；2、对两亲本进行转录组测序，分析重要基因的序列和表达量的差异；3、鉴定mc候选基因，在多室亲本中进行遗传互补测验；4、候选基因的时空表达与蛋白质亚细胞定位分析；5、构建MC/mc的近等基因系并进行表型观察；6、根据转录组测序结果，对候选基因相关的代谢调控基因进行表达分析，研究多室性状的遗传调控机理；7、在芥菜型和甘蓝型的多室油菜中开展mc同源基因的克隆与序列分析，研究mc基因的进化。通过上述工作，成功克隆mc基因，明确其功能，揭示多室性状形成的遗传机理，为油菜产量的遗传改良奠定理论基础。

多室性状是油菜的高产相关性状，目前对其调控的分子机理还未见报道。在前期研究中，我们发现白菜型油菜黄籽沙逊的多室性状是由位于A4染色体上的单个隐性基因位点ml4控制。在此基础上，本研究对该基因位点开展了基因克隆的相关工作。通过突变体的表型分析发现多室材料的茎顶端分生组织随着植株的发育较正常两室材料明显增大。增大的茎顶端分生组织可能是花器官数、心皮数和每角粒数等性状增多的原因。组织切片发现角果的多室发育来自于雌蕊发育早期增加的心皮数。我们通过图位克隆的方法确定ML4基因为拟南芥CLAVATA3 (CLV3)的同源基因，编码一种小的分泌性多肽信号分子。两亲本的等位基因比较测序分析发现，多室材料中ml4基因发生了一个C/T的SNP突变，并导致CLE的保守结构域的第九位脯氨酸发生氨基酸的替换。通过体外多肽的处理实验、拟南芥和白菜型油菜中的转基因互补实验，我们证实该C/T的SNP突变是引起多室性状产生的碱基变异。进一步的基因表达分析发现在多室材料中CLV/WUS反馈调节环的负调控途径受阻，并由此提出了白菜型油菜多室性状形成的分子调控模型。我们还构建了白菜型油菜多室近等基因系，对近等基因系产生的BC4F2群体进行了BrCLV3基因型的鉴定以及单株的性状考察。结果表明Brclv3突变基因不仅能够产生多室角果，而且能够增加每角果粒数和千粒重、缩短角果长度，而对株高无显著影响。因此，该基因在油菜的产量育种中具有很好的潜在应用价值。我们还对桑日白多室油菜进行了突变表型观察和遗传分析，发现该突变材料也是由BrCLV3基因的一个C/G单核苷酸突变引起。此外，我们从甘蓝型油菜中克隆了CLV3同源基因，发现甘蓝型油菜仅存在BnA04.CLV3和BnC04.CLV3的两个拷贝，为后续在甘蓝型油菜中的多室性状研究奠定了基础。