油菜一个新的粒重和角果长度多效性主效QTL的图位克隆和功能分析

Seed weight is one of the important yield components in rapeseed (Brassica napus L.), but its regulation mechanism is unclear. Our study showed that the natural variation of seed weight is mainly determined by maternal genotype in rapeseed. In addition, two major pleiotropic QTLs for seed weight and silique length were detected in rapeseed, which are inferred to affect the seed size (filial generation, sink organ size) through regulating the silique length and its photosynthetic area (mother plant, source organ size) and photosynthate gross. Of which one new major QTL (uq.A9-1) have been fine-mapped to 14 kb interval, which also showed large effect on seed yield. Two candidate genes were identified through the comparative sequencing and bioinformatic analysis. In this project, the candidate genes will be validated by association analysis and genetic complementation test. In addition, the silique wall and seed of uq.A9-1 transgenic lines will be subjected to cytological, physiological, biochemical, transcriptomic and metabolomic analysis. More importantly, the uq.A9-1 gene will be subjected to enhanced and repressed expression, temporal and spatial expression, subcellular localization, protein interaction and haplotype analysis. Taken together, we will demonstrate the regulation mechanism of uq.A9-1, identify its elite alleles and develop the corresponding functional markers. This project will uncover the key gene and its regulation mechanism underlying the maternal control of seed weight in rapeseed, and provide the theoretical guidance and technical support for the molecular improvement of seed weight and yield.

粒重是油菜产量重要构成，但调控机制不清楚。本课题组研究发现油菜粒重的自然变异主要由母体基因型决定，并检测到2个控制粒重和角果长度的多效性主效QTL，推测它们通过调控角果长度及光合作用面积（母体，“源”器官大小）来影响光合产物总量和种子大小（子代，“库”器官大小）。其中一个新主效QTL（uq.A9-1）已被精细定位到14kb区段内（对产量也有很大效应），并通过比较测序和生物信息学分析确定了2个候选基因。在此基础上，本项目拟对候选基因进行关联和遗传互补验证确定目的基因，对uq.A9-1转基因株系角果皮和种子进行相关细胞学、生理生化、转录组和代谢组分析，对uq.A9-1基因进行增强和抑制表达、时空表达模式、亚细胞定位、蛋白互作和单倍型分析，明确uq.A9-1的调控机制，筛选优异等位基因并开发功能标记。本项目将揭示油菜粒重母体调控的关键基因及其作用机制，为粒重和产量分子改良提供理论指导和技术支撑。

粒重是油菜产量重要构成，但调控机制不清楚。本项目前期研究发现油菜粒重主要决定于由母体基因型效应，并利用中双11号和No.73290构建的F2:3家系群体检测到两个主效QTL。其中uq.A9-2对应已克隆的油菜粒重基因BnaA9.CYP78A9（Shi et al., 2019）, 而uq.A9-1已被精细定位到14kb区段，同时影响叶绿素含量、光合速率和粒重。两亲本目标区段BAC物理图谱的比较和生物信息学分析确定了2个候选基因，其中BnaA9.SEC31B在No.73290中缺失了，而BnaA9.FC2在No.73290中的表达量显著高于中双11号。中双11号BnaA9.SEC31B基因敲除后每角粒数降低而粒重增加，叶绿素含量和光合速率无显著变化。NIL中BnaA9.FC2基因被编辑和RNAi干扰后，叶绿素含量、光合速率和粒重均显著降低。No.73290中BnaA9.FC2基因全长转入Westar后上述性状均显著增加，这证明BnaA9.FC2就是uq.A9-1的目标基因。时空表达模式分析结果表明BnaA9.FC2主要在绿色组织中表达，且在No.73290中的表达量显著高于中双11号。亚细胞定位表明，BnaA9.FC2蛋白主要定位在质膜、质体和叶绿体中。酵母双杂结果表明，BnaA9.FC2与BnaPPI蛋白互作。BnaA9.FC2基因编码亚铁螯合酶，是血红素合成的终端酶。和NIL相比，中双11号中BnaA9.FC2基因表达量降低，这导致其血红素、类胡萝卜素和叶绿素含量降低。中双11号BnaA9.FC2基因被敲除之后，进一步导致叶片泛黄、生长迟缓，最终粒重和产量降低。为进一步找到BnaA9.FC2在两亲本中表达量差异的原因，对其启动子区进行截断和序列交换分析，鉴定到一个39bp的序列可以正调控该基因的表达。进化分析表明：该39bp的顺式调控序列来源于白菜，在不同的白菜品种中存在0-2个拷贝数的变异，该序列是芸薹属特异，并且在进化过程中高度保守。综上所述，一个来源于白菜的高度保守的正调控FC2基因表达的39bp序列的拷贝数变异可以影响其生化途径中叶绿素含量的差异，进而影响光合速率和光合产物总量及其向种子中的转运和贮藏，最终影响种子填充、大小和重量。这一原创性发现进一步丰富和完善了油菜粒重母体调控理论，为油菜产量改良提供了新的途径。