甘蓝型油菜多室种质资源创新及其形成的分子机理研究

Multilocular rapeseed has great potential for the development of high-yield crops. In Brassica napus, the molecular basis of the important trait is poorly understood because of lacking multilocular germplasm resources, which also retards its application in practical breeding. Because of the limited capability of simultaneous modification multiple loci, the traditional technologies of genetic modification are difficult to create multilocular germplasms in this polyploid crop. Therefore, we established the CRISPR/Cas9 genome editing system in rapeseed in previous study, and successfully generated transgenic rapeseed plants that carry mutations in all three alleles of an important multilocular candidate gene CLV3 in Brassica napus. In the present project, we will conduct the following works in Brassica napus: 1) to systematically create single-targeted gene mutants (including plants mutated in a specific allele or several homoeoalleles) for several important candidate genes in the CLV pathway, and identify their functions in the development of multilocular silique, and then determine the functions and relationships of different copies of each multilocular gene; 2) to pyramid multiple mutated genes/loci by crossing of different multilocular single mutants, and conduct pathway-level studies on the genetic regulation of different multilocular genes; 3) to introduce the new generated multilocular alleles into elite rapeseed cultivar, and assess their potential in breeding application preliminarily. These works will help to realize innovation of multilocular germplasm resources in Brassica napus, and provide important information and insights into the molecular mechanism of multilocular silique development, as well as new allelic variants and efficient tool for molecular design breeding in rapeseed.

多室油菜在高产育种中具有很大应用潜力。甘蓝型油菜中由于缺乏这种资源，限制了该性状的分子机理研究与育种应用；而传统的遗传修饰技术同时改造多位点的能力有限，很难在该多倍体作物中用于创建多室突变体。因此，在前期研究中申请人建立了油菜中的CRISPR/Cas9技术体系，并成功对多室候选基因CLV3的所有同源拷贝进行了编辑。在此基础上，本研究拟在甘蓝型油菜中开展以下工作：1、系统创建CLV途径中多个重要多室候选基因的单基因突变体（包括单个特异拷贝、多个同源拷贝的突变体），鉴定出其中的多室基因，明确各基因的不同拷贝在多室形成过程中的功能及相互关系；2、通过杂交聚合产生多基因突变体，从调控途径上研究不同多室基因间的相互关系；3、将创建的多室基因资源转育到优良油菜品种中，初步评价其应用潜力。通过上述工作，实现甘蓝型油菜多室种质资源创新、解析该性状形成的分子调控机制，为油菜的分子设计育种提供新材料和方法。

多室油菜在高产育种中具有很大应用潜力。甘蓝型油菜中由于缺乏这种资源，限制了该性状的分子机理研究与育种应用。因此，我们在甘蓝型油菜中对CLV途径中几个重要多室候选基因进行了克隆，并利用CRISPR/Cas9技术体系成功创建了BnaCLV3信号肽及其信号识别受体BnaCLV1、BnaCLV2和BnaRPK2等基因的突变体。这些创建的突变可以稳定遗传到后代，并在后代鉴定到各基因的纯合突变体，包括单个特异拷贝和多个同源拷贝的纯合突变体。表型分析发现，只有在它们的同源拷贝都突变时才能产生多室表型，而它们的单拷贝突变体都没有多室产生，表明它们的同源拷贝间具有功能的冗余性。其中，BnaRPK2的纯合突变体仅个别角果多室，表明该基因不是油菜多室形成的重要基因；BnaCLV1、BnaCLV2和BnaCLV3纯合双突变体的平均多室角果比例分别为15.41%、43.6%和100%，表明BnaCLV3在油菜多室形成过程中最为主要。进一步对BnaCLV3纯合双突变体材料进行表型分析发现其叶片数极显著增多、花序分生组织增大、花器官数目增多、多室角果的每角果粒数和千粒重均极显著增加，表明BnaCLV3突变体具有增产潜力。利用RNA-seq技术分别对白菜型油菜的Brclv3突变体和甘蓝型油菜的多室突变体（包括BnaCLV3、BnaCLV1和BnaCLV2等基因的纯合双突变材料）在不同花序发育时期相对于野生型的基因表达变化进行了系统的分析，最终筛选出55个重要的参与甘蓝型油菜多室形成候选基因，并构建了编辑载体用于基因功能的验证。此外，将BnaCLV3突变基因型转育到优良品种中双11遗传背景中，并对转育材料进行了初步的评价。通过上述工作，我们创建了甘蓝型油菜多室新资源，初步解析该性状形成的分子调控机制，为油菜的分子设计育种提供新材料和方法。