成骨与骨细胞网络内力致钙信号响应与传递的定量规律研究

骨内主要有三类细胞，骨细胞位于骨陷窝内，通过间隙连接形成骨细胞的三维网络并与位于骨小梁表面的成骨、破骨细胞相互作用。外力作用下这三种细胞的协同作用控制着骨组织的生长和退化。在申请者此前关于成骨细胞的研究工作基础之上，为进一步确认"在骨内细胞间力致钙信号传递过程中胞外ATP的扩散可能比细胞间间隙连接更为重要"这一初步结论，并将研究对象扩展至骨细胞以及成骨与骨细胞之间相互作用，本项目拟利用自组装分子单层技术建立可控细胞铺展形状及间距的、具有功能化间隙连接或无直接物理连接的成骨或骨细胞网络，并结合电化学技术探索建立成骨与骨细胞的共培养系统。针对以上细胞模型，将定量测量流体剪切力和压力作用下成骨或骨细胞网络内以及成骨与骨细胞之间力致钙信号响应与传递的定量规律，以期在细胞/分子水平解释力学刺激下骨生长与重建的生物学机制。

虽然人们早已知道骨会改变其结构以适应力学环境，但骨内细胞感受、传递力学刺激，以及调控骨形成和骨吸收的机制仍有大量未知问题。本项目主要关注骨内各类细胞的力致“钙呼吸”现象以及细胞-基质间相互作用，并开展了以下三个方面的研究。1）无物理连接成骨细胞的力致钙响应。为了研究间隙连接和ATP分别在力致胞间钙传递过程中的作用，我们应用微模式化方法建立了无间隙连接的成骨细胞阵列。对细胞施加流体剪切力后，发现细胞间无物理连接时，仍会出现多个钙响应峰；而除去胞外或胞内钙时，只有不到一半的细胞发生钙响应；阻断胞外ATP通路后，只有约五分之一的细胞有钙响应，且大多为单峰。以上结果说明细胞间的间隙连接不存在时，ATP是介导细胞间钙传递的主要途径，而间隙连接并非必需途径。2）不同分化阶段破骨细胞的力致钙响应。在破骨细胞的不同分化时间点，使用流动腔加载系统对破骨细胞施加了不同大小的流体剪切力，记录并分析细胞内钙离子浓度的动态变化。研究结果表明流体剪切力可诱发破骨细胞钙振荡的发生，但分化后期的成骨细胞的钙振荡能力减弱。进而使用7种不同试剂分别阻断钙响应通路，发现力敏感膜离子通道、PLC或内质网中钙池是破骨细胞流体剪切力产生钙响应的主要通路。3）成骨细胞铺展形状对其凋亡和分化的调控作用。我们构建了具有不同圆度的微模式化表面，然后在接种后不同时间点测量了成骨细胞的凋亡比例，进而测量3种成骨向分化标志物的表达量。结果表明对于具有相同铺展面积的细胞，当允许其铺展形状具有较长的细胞突起（或有较小的圆度）时，其凋亡率显著降低。更为重要的是，具有较大圆度的成骨细胞的成骨向分化比例显著高于低圆度。以上研究结果表明具有较长细胞突起的成骨细胞更易存活，但不利于分化的发生。在此项目的资助下共发表杂志论文5篇，其中SCI收录论文3篇，EI收录论文4篇，杂志邀请综述2篇，封面论文1篇。