基于线粒体蛋白质组学的针刺治疗阿尔茨海默病的分子机制研究

Reaserch shows that oxidative damage is the earliest event in Alzheimer disease.Mitochondria is the main source of free oxygen radicals in cells, occupying a central position in the oxidative stress response in the brain of AD patients. Some scholars thus have proposed the "mitochondrial cascade hypothesis" of AD pathogenesis, a research focus of AD in recent years. Shenshu(BL23), Baihui(GV20), Xuehai(SP10),Geshu(BL17) were selected as the basic acupoints for acupuncture of reinforcing kidney and activating blood. Preliminary studies have shown that it could improve the cognitive function of patients with AD and AD model mice.Comparative proteomics study found that acupuncture intervention affects the protein expression in hippocampus of SAMP8 mice. A variety of differentially expressed proteins related with oxidative stress were identified,such as aconitase, cytochrome C oxidase, and neuroglobin,so mitochondria may be the main subcellular therapeutic target of acupuncture. The present study intends to use subcellular proteomics,western blot, PCR, immunohistochemical methods to identify and verify differences in protein expression of hippocampal mitochondria after acupuncture intervention. Based on bioinformatics methods,we try to build molecular signaling networks of therapeutic targets of acupuncture with nourishing kidney and activating blood method in mice model of Alzheimer's disease,thus to explain the molecular mechanisms of acupuncture in the prevention and treatment of AD from the angle of sub-cellular protein research.

研究表明氧化应激是AD患者脑内最早发生的病理事件，线粒体是细胞内氧自由基的主要来源，在AD患者脑内氧化应激反应中占据中心地位，有学者据此提出了AD发病机制的"线粒体级联假说"，成为了近些年AD研究的热点。补肾活血针刺法取肾俞、百会、血海、膈俞为基本穴位，前期研究表明它能够改善AD患者以及AD模型小鼠的认知功能，采用比较蛋白质组学研究了它对SAMP8小鼠海马蛋白质表达的影响，鉴定出多种与氧化应激相关的差异表达蛋白，如线粒体乌头酸水合酶、细胞色素C氧化酶以及脑红蛋白，说明线粒体可能是补肾活血针刺法发挥治疗作用的主要"亚细胞器靶点"。本项目拟采用亚细胞蛋白质组学、Western Blot、PCR、免疫组化方法比较、鉴定并验证针刺干预后SAMP8小鼠海马线粒体差异蛋白的表达，基于生物信息学方法构建补肾活血针刺法治疗作用的分子信号网络，从亚细胞蛋白研究的角度阐释补肾活血针刺法防治AD的分子生物学机制

阿尔茨海默病(AD)是一种病因复杂的神经退行性疾病，时至今日，仍无治愈之法。大量证据表明：线粒体结构及功能异常在AD的发病过程中起着重要作用。本研究通过观察针刺对阿尔茨海默病模型小鼠快速老化小鼠P8 (SAMP8)行为学的影响，采用比较蛋白质组学方法分析针刺干预后SAMP8小鼠海马线粒体的差异蛋白质表达，采用western blot验证部分差异蛋白质表达水平，在线粒体蛋白质的层面上寻找针刺治疗AD的潜在作用靶点蛋白，从亚细胞器蛋白研究的角度阐释其治疗AD的分子生物学机制。结果表明：干预后Morris水迷宫实验中，与模型对照组相比较，针刺治疗组小鼠的逃避潜伏期时间明显缩短(P<0.05)，穿越原平台次数及停留在原平台象限的时间明显增加(P<0.05)；与正常对照组相比较，模型对照组小鼠的逃避潜伏期时间明显延长(P<0.05)，穿越原平台的次数及停留在原平台象限的时间较正常对照组小鼠明显减少(P<0.05)；与模型对照组相比较, 非穴位对照组小鼠的逃避潜伏期时间，穿越原平台的次数及停留在原平台象限的时间无明显变化（P＞0.05)。将模型对照组海马线粒体的2-DE图谱作为参照物，正常对照组、针刺治疗组及非穴位对照组小鼠的2-DE图谱分别与之比较，结果发现正常对照组与模型对照组之间有32个差异点；针刺治疗组与模型对照组之间存在38个差异点；非穴位对照组与模型对照组之间存在13个差异点。正常对照组随机选取16个差异点，得到鉴定的最终有11个点，表达上调有9个，下调有2个；针刺治疗组随机选取19个差异点，得到鉴定的有13个点，表达上调有9个，表达下调有4个；非穴位对照组随机选取10个差异表达点，得到鉴定的有4个点，表达上调有2个，下调的有2个。根据蛋白质数据库提供的信息，针刺干预后有表达差异的蛋白之中，绝大部分主要涉及线粒体功能以及结构的调节。Western blot结果也验证了针刺治疗后SAMP8小鼠海马线粒体ATP合成酶β亚单位（ATPB）、NADH—辅酶Q氧化还原酶(NDUS1)、神经丝蛋白轻链多肽（NFL）、微管蛋白beta-2a链（TBB2A）表达水平，均呈现上升的表达趋势(p<0.05)，与蛋白质组学结果一致。上述结果提示：针刺具有改善AD模型小鼠SAMP8学习记忆能力的作用，其治疗作用机制可能涉及针刺对海马线粒体结构以及功能的双重修复作用。