基于靶向蛋白质组学筛选技术的阿尔茨海默病早期诊断生物标志物研究

Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease that slowly destroys memory and thinking ability, resulting in behavioral changes. Since the manifestations of senile plaques and neurofibrillary tangles can not yet be fully captured with current imaging techniques, the definitive diagnosis of AD can only be performed at necropsy. In addition to identifying markers that differentiate between AD and controls, it is of interest to look for better biomarkers to predict cognitive decline and neocortical amyloid burden in Subject Congnition Decline (SCD), Mild Cognitive Impairment (MCI) or clinical AD patients. Minimally invasive and cost-effective blood biomarkers are ideal. This project proposed the idea of using β-secretase(BACE1) and neurogranin (Ng) as targets and screening a group of proteins as AD markers. Based on targeted quantitative proteomics and neural-specific exosome-enrichment and immunoprecipitation, a group of BACE1 and Ng-related AD early biomarkers will be determine in blood samples of AD early patients, which is further verified by the blood samples of various periods AD patient. The aim is to obtain a set of blood biomarker candidates with high sensitivity and high reliability for the pathogenesis of AD and to provide basic research support for the early diagnosis of AD.

阿尔茨海默病（AD）是一种渐进性神经退行性疾病，其慢慢地破坏记忆力和思维能力，导致行为改变。目前，脑内的老年斑和神经原纤维缠结尚不能用的成像技术完全呈现，AD的明确诊断只能在尸检时。 除了鉴别区分AD与对照的标志物外，更意义的是寻找更好的生物标志物来预测主观认知下降、中度认知障碍或临床AD患者的认知能力下降和新皮质淀粉样蛋白负荷的发生率，而从血液中寻找到与AD相关的生物标志物是最理想的。本项目提出以β-分泌酶（BACE1）和神经颗粒素（Ng）为靶点蛋白，筛选一组与其相关的蛋白作为AD可能的标志物，通过基于靶向定量蛋白质组学和神经特异性血浆外泌体富集和免疫沉淀等技术，利用AD早期病人血液样品确定一组与BACE1和Ng相关的AD早期生物标志物，而后使用各时期AD病人血液样本进行验证。旨在获得一组对AD病理发生过程具有较高敏感性和可靠性的血液生物标志物候选物，为AD的早期诊断提供基础研究支持。

阿尔兹海默病是一种神经退行性疾病，患者表现出明显的病理特征时就已进入了中晚期阶段且无法治愈，近几年新提出的主观认知障碍（SCD）的阶段可作为早期诊断的新方向。而临床上对MCI患者的诊断主要是量表测试、脑脊液检测和影像技术。它们分别存在着检测时效性低、侵入性强和价格昂贵等问题。外泌体作为内含生物分子的囊泡结构，更容易通过血脑屏障进入血液，可作为在血液中诊断AD的桥梁。本课题在提取血液神经源性外泌体的基础上，一是通过质谱蛋白质组学的方法检测已知生物标志物在SCD阶段的变化；二是通过组学数据和机器学习的方法探寻其中的差异蛋白。课题取得了以下成果：.1.用与AD病理早期可塑性相关的神经颗粒素（Neurogranin，Ng）作为靶蛋白，并克隆并过表达了Ng，获得其特异性肽段作为之后的质谱定量基础，在最终12例血液样品中仅有一例检出Ng，具体的技术还在改善和提高中。.2.引入生物素链霉亲和素系统，对神经细胞黏附分子（Neural cell adhesion molecule，NCAM）的生物素标记，特异性富集了神经源性外泌体。随后所获得的神经源性外泌体，得到了总蛋白715个，一半以上样品中检出的蛋白526个；对这526个蛋白的分析得到了全阶段差异蛋白12个，SCD阶段差异蛋白6个。.4.应用基于机器学习的 SVM-RFECV（支持向量机-递归特征消除-交叉验证）算法从 5 个不同队列的 AD 脑脊液蛋白质组数据集中筛选出 12 种蛋白质组，构建一种从控制中识别 AD 的高精度稳健方法。 12 种蛋白质参与了几个 AD 相关的生物学过程，并与经典的 AD 致病生物标志物（Aβ、tau/p-tau 和蒙特利尔认知评估 (MoCA) 评分）高度相关。 它还能够区分 AD 的早期阶段（轻度认知障碍，MCI）以及其他神经退行性疾病。该算法在识别AD方面具有预测能力强、准确率高、可靠性好等优点，可为AD的临床诊断提供依据。