我国鸡马立克氏病毒遗传进化及变异毒株特性分析

In recent years, neoplastic viral diseases still infrequently occurs even though almost all layer and breed flocks in China are vaccinated with the GaHV-2 vaccines, leading huge economic significance to the poultry industry. Our previous study indicated that the existence of variant GaHV-2 strains was a possible reason of immunity failure in China. The vaccine cannot effectively inhibit the replication of variant GaHV-2 strains. In order to elucidate molecular mechanisms of the virulence evolution and pathogenesis of variation strains. GaHV-2 field strains isolated from different time and territories of China as the research objects, understand the variation of GaHV-2 field and vaccine strains at the genomic level using next generation sequencing technology. Experimentally-infected SPF chickens with these isolates may differentiate the prototype and variation strains. Differentially expressed proteins and epitope evolution will be determined using transcriptomes and/or proteomic analysis. Then, CRISPR/Cas9 technology will be used for the precision editing the GaHV-2 field strains. The reproduce individuality in vivo, shedding, transmission of the recombinant virus indicate the molecular mechanisms of pathogenic characteristics change of variant GaHV-2 strains. This provide more sustainable control of MD for development of improved vaccines.

近年中国的蛋鸡和种鸡群普遍1日龄免疫鸡马立克氏病（MD）疫苗，但常有MD发生，给养禽业带来严重的经济损失。前期研究表明，我国存在能够突破疫苗保护的鸡马立克氏病毒（GaHV-2）变异毒株，体内复制能力的动态分析发现变异毒株体内复制增强，且疫苗不能有效抑制其增殖。为了阐明变异毒株进化和致病的分子机制，本项目以不同时间和地域分离的病毒株为研究对象，通过高通量的二代测序方法从全基因组水平分析我国GaHV-2流行毒株的遗传演化规律和特点；结合感染动物试验筛选原型和变异病毒株，再通过转录组和/或蛋白组的比较分析差异表达蛋白；进而通过CRISPR/Cas9技术构建替换差异基因的嵌合病毒，用嵌合病毒感染SPF鸡，通过荧光定量PCR检测不同感染期病毒在体内复制能力，排毒和肿瘤的形成等多方面评价其致病性和疫苗对不同嵌合病毒的免疫保护效果，以期鉴定变异毒株致病特性改变的分子机制，为MD新型疫苗的研制奠定基础。

近年我国的蛋鸡和种鸡群普遍1日龄免疫鸡马立克氏病（MD）疫苗，但常有MD发生，给养禽业带来严重的经济损失。因此有必要了解我国近年来鸡群中鸡马立克氏病病毒（GaHV-2）感染和流行，以及其与其他病原混合感染的情况；在持续监测中，从一个被检鸡群采集的19份样品，经132bpr的PCR检测发现6份为3个拷贝数，14份为2个拷贝数，其中一份为2个和3个拷贝数都有。通过特有基因meq，RLORF4，PP38的序列分析证实该鸡群中存在至少2个不同分子特征的GaHV-2株。文章发表在《veterinary microbiology》杂志。.从GaHV-2阳性样品中分离获得CEF适应的细胞毒株。筛选BS/15病毒株进行致病性及现有疫苗免疫保护性实验。结果表明90天试验期内该病毒株能引起SPF鸡100%发病，肿瘤率达到64.3%，死亡率为85.7%；临床常用的MD疫苗CVI988和814株对其免疫保护指数均较低，分别为33.3和66.7。结果显示免疫失败鸡群或许是流行毒株变异导致的。这部分内容发表在《Viruses》杂志。GaHV-2感染过程中，宿主干扰素反应在抗病毒感染中起重要作用，我们通过分析变异毒株感染SPF鸡后I型干扰素的表达水平，发现变异毒株的感染能够抑制I型干扰素的表达，从而逃避免疫。这部分内容发表在《Veterinary Immunology and Immunopathology》杂志。.通过流行病学调查发现GaHV-2与REV混感严重，通过GaHV-2和REV共感毒株和人工混合感染GaHV-2和REV的致病性分析表明混合感染显著增加了疾病的严重程度，并降低MD疫苗的免疫效力，提示混感是目前造成养禽业经济损失的重要原因之一，文章发表在《Veterinary microbiology》和《Viruses》杂志上。而且，在一个GaHV-2和REV混感的鸡群中还分离获得REV LTR插入GaHV-2的重组毒株，对SPF鸡的致病力低，文章发表在《Virus Genes》杂志。.为了研究GaHV-2差异基因对致病特性的影响，我们应用同源重组和CRISPR/Cas9技术对GaHV-2毒株进行编辑，成功获得2株meq基因缺失株。为我们进一步替换差异基因奠定基础。其中BS/15的meq基因缺失毒株的构建发表在《中国家禽》；另一篇文章发表在《Vaccine》杂志，这株meq基因缺失病毒