鸡马立克氏病毒流行毒株生物学特性分析

Marek's disease virus (MDV)Is a ubiquitous, lymphotropic alphaherpesvirus. MD has been a major concern in the poultry industry owing to the emergence of increasingly virulent strains over the last few decades that were isolated in the face of comprehensive vaccination. A scheme to classify the virulence of individual MDV strains has now been established, and the spectrum ranges from mildly virulent (m) to virulent (v), very virulent (vv) and very virulent plus (vv+). In order to monitor changes to MDV predominant strains and the fundamental mechanisms that drive virus evolution, MDV field strains were isolated from several territories of China during lately years. Virulence related genes of the strains were sequenced, and the sequences reveal some regular mutations. Artificial challenge to SPF chickens with these isolates elucidate their reproduce individuality in vivo, tissue tropism, pathogenicity and horizontal transmission. Analysis of the regular mutations of virulence genes and virulence, selected strain was cloned as Bacterial Artificial Chromosomes. The recombinant virus was gene substitution with other virus gene. The generation of the BAC clones of MDV is a significant step in unraveling the oncogenic determinants of this virus.

鸡马立克氏病毒(MDV)是一种亲淋巴的细胞结合性疱疹病毒，能引起鸡的恶性淋巴肿瘤疾病。MDV的毒力在不断的增强,从温和型毒株(mMDV)到强毒株(vMDV)、超强毒株(vvMDV)再到特超强毒株(vv+MDV),分别突破了同期使用疫苗的保护，给养鸡业造成巨大经济损失。为了监测MDV在中国流行的病毒株毒力的进化以及阐明毒力进化的机制，本课题以中国不同年代，不同地区分离的MDV野毒株为研究对象，通过致病相关基因序列分析，揭示国内MDV流行毒株致病相关基因变异规律；通过人工感染动物实验，应用实时荧光定量PCR，病理组织学方法等，阐明国内MDV流行毒株体内复制特性，组织嗜性，致病性和水平传播能力。结合MDV流行毒株基因变异规律及毒力变异情况，构建细菌人工染色体重组MDV，进行基因置换或突变，研究重组病毒的致病性变化，阐明该基因在毒株毒力变异中所起到的作用。探索MDV毒力变异的分子基础。

在持续监测鸡马立克氏病病毒（GaHV-2）中国流行毒株毒力进化的过程中，我们从2011年到2013年从中国10个省份的不同鸡群共分离了43株细胞适应病毒株，这些病毒株均能引起鸡胚成纤维细胞（CEF）的细胞病变，经GaHV-2基因组132bp重复序列的PCR检测，表明这43株均为2或3个拷贝，符合GaHV-2强毒的特点。其主要致瘤基因meq基因序列为1020bp，编码339个氨基酸。与国际标准强毒株GA比较发现，中国流行毒株meq基因主要特点为K77E, D80Y, V115A, T139A, P176R, and P217A，而且139和176位氨基酸的突变毒株比例增加。与GenBank中发表的124株国内外参考毒株构建meq基因核苷酸进化树，结果提示不同的程度变异毒株存在于中国鸡群。为了研究分离毒株毒力，选取meq基因具主要特点的6株病毒进行致病性及免疫保护试验，结果表明6株MDV流行毒株均可造成SPF鸡的发病，且发病特征不同；疫苗CVI988对其免疫保护也存在显著的差异，对其中1株的保护指数低于70，体内复制能力的动态分析也发现，疫苗不能有效抑制该毒株的增殖。该项研究证实我国流行的鸡马立克氏病毒株致病性具有多样性，并首次发现我国现地存在现有疫苗CVI988（Rispens株）难以提供有效保护的变异毒株。为研究流行毒株在鸡体内的复制能力及疫苗对野毒株复制的干扰能力，通过荧光定量PCR法动态检测了羽髓中的病毒载量，结果表明疫苗CVI988不能有效抑制LTS株在体内的复制，或许是导致其免疫失败的原因。另外在分离病毒过程中也获得2株GaHV-2与禽网状内皮组织增生症病毒（REV）混感毒株，对其中一株CYM+R进行致病性试验表明，该混合感染病毒株对SPF鸡的致病性较其他GaHV-2的致病性显著增强，利用细菌人工染色体技术，对MDV和REV的混合培养物CYM+R中的MDV进行分子纯化，获得一株纯净的MDV毒株，并通过二代全基因组测序分析其全病毒基因组。遗传进化树分析表明该株MDV毒株表现出与中国流行毒株具有非常接近的遗传进化关系，并未有明显的进化。表明MDV和REV的混合培养物CYM+R的高致病能力并不是其中的MDV毒株发生显著进化造成的，更有可能是由于其于REV混合感染的结果。本研究对鸡马立克氏病的防控具有重要意义。